廣西地方標準《厚藤質量控制技術規程》（征求意見稿）編制說明一、項目來源根據《關于下達2016年第六批廣西地方標準制定（修訂）項目計劃的通知》（桂質監函〔2016〕324號）文件精神，由廣西中醫藥大學提出，由廣西中醫藥大學起草廣西地方標準《厚藤質量控制技術規程》（項目編號為2016-06065）。二、項目背景及目的意義厚藤Ipomoeapes-caprae(L.)Sweet為旋花科(Convolvulaceae)番薯屬(Ipomoea)多年生匍匐蔓生草本植物，廣布于全球熱帶及亞熱帶沿海地區，在我國廣泛分布于浙江、臺灣、福建、廣東、廣西、海南等熱帶和亞熱帶海灘上。厚藤為廣西特色海洋中藥，同時還具有多種實用價值，可用于食品、飼料等行業，市場遠景廣闊。因此，為了更好地保護和應用這一植物資源，提高其質量和創匯能力，促進其推廣應用，我們提出了制定《厚藤質量控制技術規程》的建議。三、項目編制過程（一）成立標準編制工作組本項目實行在項目主持人負責下的小組負責制，各個實施單位指定研究小組組長和成員后，對項目任務進行分解和分配，明確各小組的責任、項目實施計劃，對小組成員的職責和進度進行細化，確保項目高效如期進行。在標準項目下達后及時成立了以廣西中醫藥大學侯小濤教授主持，鄧家剛、郝二偉、杜正彩、秦健峰、馮小慧為參與成員的標準編制小組，及時部署了標準編制的工作方案和時間進度表。在標準起草前，研究了厚藤的相關文獻資料，并對課題研究成果進行了全面整理和總結討論。在編制過程中，還深入廣西各大主要產區廣泛資源調查，同時咨詢了相關權威專家，力爭編制工作過程科學、嚴謹，方法、技術路線正確。（二）收集整理文獻資料以及前期工作基礎迄今為止，標準起草小組成員對厚藤相關研究進行了大量的文獻收集以及進行了一系列藥效篩選及化學成分的初步研究。厚藤不僅是具有綠化、防風固沙、抵御自然災害、恢復生態等功能的海灘景觀植物，也是中國南方沿海的民間常用海洋中藥、京族習用植物藥。《中華海洋本草》、《中華本草》、《廣西藥用植物名錄》等多部著作中均有該植物藥用的記載，中醫認為其味辛、苦，性微寒，歸肺、肝、胃、大腸經，具祛風除濕、消癰散結、拔毒消腫的功效，民間應用于治療腰肌勞損、風濕關節痛、腰腿痛及瘡癤、痔瘡、海蜇引起的皮炎。厚藤在其他多個國家民間醫學領域均有悠久的應用歷史，如：澳大利亞土著人用于治療傷口、蟲毒引起的皮膚炎癥、淋巴結結核、高血壓、偏頭痛，墨西哥民間用于治療腎炎，泰國民間用于治療水母毒素引起的炎癥，巴西民間用于治療疝氣、排尿障礙、淋病，巴基斯坦也將其作為代茶飲?，F代研究表明，厚藤具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮痛、抗膠原酶、抗氧化、免疫調節等多種藥理活性。厚藤具有悠久的傳統應用歷史和明確的藥理活性，且資源豐富易得，但至今未有質量標準，因此，本研究以海洋中藥厚藤為對象，對其質量標準進行研究：建立了厚藤的薄層色譜鑒別法；測定了厚藤的水分、總灰分、浸出物的含量；建立了HPLC法測定六個成分的方法；采用以綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的總含量為考察指標，通過單因素試驗及響應面試驗優化提取工藝；結合化學計量法建立HPLC及UPLC指紋圖譜，生成指紋圖譜共有模式，本課題可為該海洋中藥的臨床應用、質量控制和產品開發等提供參考。（三）研討確定標準主體內容標準編制工作組在對收集的資料以及前期研究基礎進行整理研究之后，標準編制工作組召開了標準編制會議，對標準的整體框架結構進行了研究，并對標準的關鍵性內容進行了初步探討。經過研究，標準該部分的主體內容確定為范圍、規范性引用文件、術語和定義、要求、試驗方法、檢驗規則、標志、包裝、運輸和貯存。（四）調研及形成征求意見稿在前期工作的基礎之上，通過理清邏輯脈絡，整合已有的參考資料中有關厚藤質量標準的要求，并結合廣西厚藤質量控制實際要求的基礎上，按照簡化、統一等原則編制完成廣西地方標準《厚藤質量控制技術規程》（草案）。2016年7月，廣西地方標準《厚藤質量控制技術規程》獲自治區質監局批準立項。2016年8月-12月，標準編制工作組組織部門有關專家征求廣西地方標準《厚藤質量控制技術規程》（草案）意見。2017年1月-2018年12月，標準編制工作組按照專家意見進行標準的完善。2019年1月-12月，標準編制工作組在南寧市組織全區相關領域專家對廣西地方標準《厚藤質量控制技術規程》進行征求意見。經過多次討論、研究，最終形成廣西地方標準《厚藤質量控制技術規程》（征求意見稿）和編制說明。四、標準主要章節內容及確定依據（一）標準涉及的技術原理及依據采用現代分析技術對厚藤的感官指標、理化指標進行分析測定，對厚藤進行質量控制是本標準制定的出發點。水分的測定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832中第二法的規定測定。總灰分的測定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2303的規定測定。浸出物的測定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2201的規定測定，用50%乙醇溶液作溶劑?？Х人岬暮繙y定：采用高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0512）測定。（二）、標準涉及技術的具體實施方案按照廣西壯族自治區市場監督管理局關于標準編制工作的要求，標準起草小組成員于項目實施期間，深入廣西防城港市、廣西北海市、廣西欽州市、海南陵水黎族自治縣、海南?？谑行阌^等地區開展資源調查、樣品采集。厚藤采集于廣西及海南，總計10批，經廣西中醫藥大學李永華教授鑒定為旋花科植物厚藤Ipomoeapes-caprae（L.）Sweet的干燥莖葉，新鮮藥材置烘箱中55℃烘干，粉碎，藥材粉末過55目篩備用，批號如表1所示；表1不同產地厚藤的樣品來源信息編號產地采收時間IP-1廣西城港市防城區2016/03/26IP-2廣西防城港市防城區江山半島—三塊石2016/06/24IP-3廣西防城港市防城區江山半島—脯魚灣2016/06/24IP-4廣西防城港市防城區江山半島—白浪灘2016/06/24IP-5廣西防城港市防城區江山半島—白沙灣2016/06/24IP-6廣西防城港市防城區-北侖河口紅樹林自然保護區2016/07/10IP-7廣西北海市合浦縣白沙鎮獨山村2016/10/15IP-8海南陵水黎族自治縣陵水英州鎮清水灣2017/02/17IP-9廣西欽州市三娘灣2017/06/12IP-10海南海口市秀英區2017/07/151.水分含量測定參照2015版《中國藥典》第四部（通則0832)水分測定法第二法烘干法，測定10批不同產地厚藤的水分，根據公式：水分含量W5%=（W2—W4）/W，計算供試品中含水分含量，結果如表2所示，10批厚藤藥材的水分含量的最大值（10.64%）上浮10%即水分含量上限，所以，暫定厚藤的水分含量不得過12%。表210批厚藤藥材的水分含量（烘干法）結果（n=2）藥材編號樣品重W/ɡ恒重后空瓶重W1/ɡ樣品重瓶重W2/ɡ干燥5h后總重W3/ɡ干燥1h后總重W4/ɡ水分含W5量/%平均值/%1-12.004069.604371.608371.400271.394910.6510.521-22.000367.367769.368069.163369.160210.392-12.000367.365469.365769.176769.16989.799.832-22.000566.645168.645668.453268.44839.863-12.000566.773568.774068.609368.60388.518.543-22.000868.194170.194970.026870.02358.574-12.000965.655167.656067.455467.453410.1310.234-22.000566.601468.601968.401868.395310.335-12.000268.483470.483670.285770.282010.0810.145-22.000966.016668.017567.817267.813510.206-12.000067.564469.564469.362669.352410.6010.426-22.000666.785868.786468.586468.581610.247-12.000167.901569.901669.695769.690710.5410.557-22.000268.267370.267570.060770.056310.568-12.000667.698669.699269.493169.485510.6810.648-22.000866.644068.644868.442368.432710.609-12.000068.064070.064069.875369.86679.869.909-22.000867.984869.985669.795769.78699.9310-12.000367.571469.571769.411869.40838.178.1910-22.000268.098270.098469.937769.93428.212.總灰分的測定參照2015版《中國藥典》第四部總灰分測定法（通則2302），測定10批不同產地厚藤的總灰分，根據公式：總灰分W5%=（W4—W1）/W，計算供試品中總灰分的百分含量，結果如表3所示，根據10批厚藤的總灰分含量最大值（14.46%）上浮10%即總灰分上限，所以，暫定厚藤的總灰分含量不得過16%。表310批厚藤藥材的總灰分含量結果（n=3）藥材編號樣品重W/ɡ恒重后空瓶重W1/ɡ樣品重+瓶重W2/ɡ灰化5h后總重W3/ɡ灰化1h后總重W4/ɡ總灰分W5/%平均值/%RSD/%1-13.002338.950341.952639.196339.19678.218.120.971-23.001040.259043.260040.499040.50068.051-33.001940.123943.125846.160540.36758.112-13.000939.660942.661839.876939.87697.207.160.942-23.000939.489042.489939.705539.70497.192-33.001839.596642.598439.813239.80917.083-13.000239.854542.854740.162540.161110.2210.140.753-23.002239.914242.916440.218240.216510.073-33.001740.228943.230640.534440.532810.124-13.001838.704241.706038.979438.97749.109.070.334-23.001840.554243.556040.827840.82569.044-33.000939.266142.267039.540539.53849.075-13.001538.686741.688239.018539.019511.0911.090.155-23.001239.763842.765040.096940.096111.075-33.000339.711242.711540.045340.044411.116-13.000738.952641.953339.382939.382714.3314.460.746-23.001540.258343.259840.693740.693714.516-33.001340.123343.124640.559240.559414.537-13.001839.657442.659239.992639.992911.1811.150.507-23.001239.480942.482139.816539.816711.197-33.000739.585942.586639.919639.918611.098-13.000739.855442.856140.107340.10708.388.370.188-23.000639.91542.915640.165740.16578.358-33.001140.230543.231640.481040.48178.379-13.001838.704641.706439.041439.038611.1311.060.869-23.000940.555343.556240.891340.888611.119-33.001439.266542.267939.598139.595210.9510-13.000438.687541.687938.966938.96469.249.190.4310-23.001439.764242.765640.042140.03959.1710-33.001239.7142.711239.987639.98509.163.浸出物的測定參照2015版《中國藥典》第四部浸出物測定法（通則2201）項下水溶性浸出物測定法，除另有規定外，以一定濃度的乙醇代替水為溶劑。本實驗對50%、70%、95%乙醇濃度及冷浸法、熱浸法進行了考察，結果如表4。結果表明，50%乙醇的浸出物均比其他濃度要高，后續試驗將50%乙醇作為溶劑。10批厚藤的熱浸法醇溶性浸出物含量均比冷浸法高，將最低測定值下浮10%作為含量下限值，綜上，厚藤藥材適宜采用50%乙醇進行醇溶性進行醇溶性浸出物檢查，規定厚藤的冷浸法醇溶性浸出物不得少于15%，熱浸法醇溶性浸出物不得少于20%。表4厚藤藥材醇溶性浸出物（熱浸法）的乙醇濃度考察結果（n=2）藥材編號乙醇濃度/%樣品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿總重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%2-150%2.000277.486877.71030.447122.3522.792-22.000580.054180.28640.464523.222-370%2.000577.736377.91850.364418.2218.472-42.000177.341777.52900.374518.722-595%2.000180.274880.38610.222811.1411.092-62.000377.135477.24580.220711.03表510批厚藤藥材醇溶性浸出物（冷浸法）的含量結果（n=3）藥材編號樣品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿總重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%RSD/%1-14.000491.991792.12180.650116.2516.370.641-24.000480.052880.18430.657816.441-34.0008102.6985102.82990.657016.422-14.000292.723992.86230.692017.3017.360.462-24.0001102.3960102.53560.698117.452-34.000271.265871.40460.693817.343-14.000677.343777.49340.748218.7018.910.993-24.000880.275880.42830.762919.073-34.000777.137077.28860.758118.954-14.000877.500977.71841.087427.1828.052.734-24.000292.388492.61501.133228.334-34.000477.737577.96661.145428.635-14.000658.013858.20740.968224.2023.941.365-24.000956.549056.74130.961824.045-34.000551.887552.07610.943023.576-14.000658.013958.19990.929923.2423.390.576-24.000356.548056.73550.937823.446-34.000751.884952.07290.940123.507-14.000758.013358.20050.935823.3923.320.257-24.000556.547156.73350.932023.307-34.000151.883652.06990.931323.288-14.000977.486877.67500.940723.5123.650.538-24.000680.050980.24040.947523.698-34.000777.735977.92600.950523.769-14.000377.343677.51440.854321.3521.570.909-24.000480.275780.44870.864621.619-34.000677.136877.31070.869621.7410-14.000158.014958.22541.052626.3126.320.3110-24.000356.549156.76031.056126.4010-34.000451.885152.09501.049526.23表610批厚藤藥材醇溶性浸出物(熱浸法)的含量結果（n=3）藥材編號樣品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿總重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%RSD/%1-12.000891.992392.21690.449022.443022.771.451-22.000580.052680.28020.455322.75831-32.0005102.6976102.92870.462223.10422-12.000692.723192.96530.484424.211724.301.032-22.0008102.3943102.64030.491924.58422-32.000877.136677.37780.482424.10843-12.000377.487077.742060.510125.499225.622.173-22.000480.051680.313860.524526.22183-32.000077.737277.988440.502625.12904-12.000477.342477.67270.660633.021432.672.184-22.000680.275180.60640.662833.12914-32.000571.265771.58430.637131.84705-12.000977.341277.641530.600730.020530.071.105-22.000380.274580.572170.595429.76655-32.000877.136477.440750.608730.42186-12.000277.340777.61700.552527.623228.212.226-22.000280.274880.55610.562628.12826-32.000971.264771.55360.577728.87007-12.000791.990192.25400.527826.37887-22.000680.052580.31100.517025.842226.111.037-32.0005102.6963102.95730.522026.09558-12.000792.723993.00280.557927.884228.531.968-22.0003102.4030102.69120.576328.81078-32.000477.136377.42530.578028.89429-12.000591.992792.25280.520226.003526.070.809-22.000780.052480.31550.526326.30389-32.0002102.6989102.95790.518125.900410-12.000392.724093.021120.594329.708529.551.0510-22.0008102.3959102.69350.595229.749110-32.000471.265771.557640.583929.19124.響應面法優化厚藤中6種成分的提取工藝及含量測定響應面法(ResponseSurfaceMethod，RSM)，通過對多因素的多個水平進行連續分析，利用回歸方程擬合出考核指標與多個因素水平間的函數關系，并以三維曲線圖的形式展示。試驗者可通過關系系數的顯著性檢驗分析、等高線圖及三維曲線圖直觀分析，判斷模型的科學性，通過軟件DesignExpert8.0.6計算得到最佳提取工藝。中藥提取中影響因素的變化通常為非線性的，響應面法適用于非線性函數關系的因素的優化，所以，響應面法具有很好的適用性；其次，較其他優化方法，響應面法的試驗點具有更好的連續分析性，提供更多的函數數據，因此在工農業、醫藥食品及生命科學領域均有廣泛應用。綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C均是厚藤中的活性成分，具有顯著的膠原酶抑制劑活性，可能對人體胚胎發育、傷口愈合、防止皮膚老化及抑制腫瘤發生等多種重要生理過程起重要作用。本研究將以上六種成分的含量為考核指標，采用響應面優化法設計試驗，對厚藤藥材的指標成分的提取工藝進行優化，并測定不同產地及不同采集時間總計20批厚藤中6種成分的含量。4.1色譜條件：色譜柱：AnglientHC-C18（2）色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1％磷酸水溶液（B）；流速：1.0mL/min；柱溫：30±5℃；進樣量：5μL；洗脫梯度：0~10min，7%~8%A；10~20min，8%~12%A；20~30min，12%~16%A；30~40min，16%~17%A；40~50min，17%~19%A；50~65min，19%~24%A；65~67min，24%~95%A；67~70min，95~95%A。檢測波長：0~15min，λ=325nm；15~55min，λ=353nm；55min~70min，λ=325nm；進樣量：5μL。綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對照品及厚藤樣品色譜圖見圖1、2。圖1混合對照品HPLC圖峰S1：綠原酸峰S2：咖啡酸峰S3：異槲皮苷峰S4：異綠原酸B峰S5：異綠原酸A峰S6：異綠原酸C圖2樣品HPLC圖峰1：綠原酸峰2：咖啡酸峰3：異槲皮苷峰4：異綠原酸B峰5：異綠原酸A峰6：異綠原酸C4.2單因素優化試驗以綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的總含量為考察指標，考察提取方法、提取溶劑、溶劑濃度、提取時間、提取次數、料液比、提取溫度等對厚藤中成分提取率的影響。4.2.1提取溶劑及方法的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計兩組8份，兩組分別以75%甲醇、75%乙醇為提取溶劑，加入60mL，平行做2份，每組內分別采用85℃水浴回流、超聲法，提取3次，每次2h，抽濾，合并濾液，將濾液轉移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉移至進樣瓶備用。按照“2.1”項下色譜條件進行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計算含量，比較不同提取方法及溶劑的提取率，結果如圖3，其中乙醇作為提取溶劑、以加熱回流為提取方法的提取率最高，因此采用乙醇回流提取法。圖3不同提取方法及溶劑對提取率的影響4.2.2溶劑濃度的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計10份，分別以50%、60%、70%、80%、90%乙醇為提取溶劑，加入60mL，平行做2份，采用85℃水浴回流提取3次，每次2h，抽濾，合并濾液，將濾液轉移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉移至進樣瓶備用。按照“2.1”項下色譜條件進行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計算含量，比較不同濃度乙醇的提取率。圖4不同乙醇濃度對厚藤酚酸類成分提取率的影響結果如圖4，當乙醇濃度小于60%時，提取率隨著乙醇濃度的增加而增加，當乙醇濃度大于60%時，提取率隨著乙醇濃度的增加而減少，可能由于乙醇濃度越大，提取出的非酚酸類雜質所占比重越大，酚酸類成分相對減少。所以，在單因素試驗后續，乙醇濃度定為60%，響應面試驗乙醇濃度的中心范圍為50%~90%。4.2.3提取時間的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計兩組10份，以60%乙醇為提取溶劑，加入60mL，平行做2份，采用85℃水浴回流提取3次，每次分別提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，抽濾，合并濾液，將濾液轉移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉移至進樣瓶備用。按照“2.1”項下色譜條件進行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計算含量，比較不同提取時間的提取率。圖5不同提取時間對厚藤酚酸類成分提取率的影響結果如圖5所示，當提取時間大于1.5h時，提取率趨于穩定，可能是由于提取1.5h時，厚藤植物細胞中的酚酸類成分已經釋放完全，并達到溶解平衡，再延長時間對提取率的影響不大。所以，在單因素試驗后續提取時間定為1.5h，響應面試驗提取時間的中心范圍為1h~2h。4.2.4提取次數的考察精密稱定厚藤藥材粉末（IP-5）約1ɡ，共計五組10份，以60%乙醇為提取溶劑，加入60mL，每組采用85℃水浴回流提取1次、2次、3次、4次、5次，每次分別提取1.5h，抽濾，合并濾液，將濾液轉移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少許提取溶劑洗出，轉移并定容于25mL容量瓶，超聲30min，搖勻，吸取2mL過0.22μm微孔濾膜，轉移至進樣瓶備用。按照“2.1”項下色譜條件進行液相分析，記錄色譜峰峰面積，計算含量，比較