動(dòng)物與家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離與修飾過得基因?qū)氲缴矬w基因組中,由于導(dǎo)入基因得表達(dá),引起生物體得性狀得可遺傳得修飾,這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)(Transgenetechnology)。人們常說得"遺傳工程"、"基因工程"、"遺傳轉(zhuǎn)化"均為轉(zhuǎn)基因得同義詞。經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾得生物體在媒體上常被稱為"遺傳修飾過得生物體"(Geneticallymodifiedorganism,簡稱GMO)。

GeneticallyModified——轉(zhuǎn)基因,簡稱GM。就是指運(yùn)用科學(xué)手段從某種生物中提取所需要得基因,將其轉(zhuǎn)入另一種生物中,使與另一種生物得基因進(jìn)行重組,從而產(chǎn)生特定得具有變異遺傳性狀得物質(zhì)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以改變動(dòng)植物性狀,培育新品種。也可以利用其它生物體培育出期望得生物制品,用于醫(yī)藥、食品等方面。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就就是基因組中含有外源基因得動(dòng)物。它就是按照預(yù)先得設(shè)計(jì),通過細(xì)胞融合、細(xì)胞重組、遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移、染色體工程與基因工程技術(shù)將外源基因?qū)刖印⒙鸭?xì)胞或受精卵,再以生殖工程技術(shù),有可能育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過生長素基因、多產(chǎn)基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生蟲基因、抗病毒基因等基因轉(zhuǎn)移,可能育成生長周期短,產(chǎn)仔、生蛋多與泌乳量高,轉(zhuǎn)基因超級鼠比普通老鼠大約一倍。生產(chǎn)得肉類、皮毛品質(zhì)與加工性能好,并具有抗病性,已在牛、羊、豬、雞、魚等家養(yǎng)動(dòng)物中取得一定成果。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1、轉(zhuǎn)基因綿羊2、轉(zhuǎn)基因鯉魚1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得發(fā)展1980年,J、W、Gordon等人首次報(bào)道用顯微注射得方法向小鼠胚胎注射純化得DNA,開辟了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究得先河。1982年,R、D、Palmiter等又報(bào)道用轉(zhuǎn)移生長激素基因得方法,獲得了7只轉(zhuǎn)基因鼠,其中1只比一般小鼠大一倍,被稱為巨鼠,引起極大得轟動(dòng)。相繼有轉(zhuǎn)基因豬、魚、兔與羊等問世。國外轉(zhuǎn)基因動(dòng)物首創(chuàng)記錄

年份研究者基因/轉(zhuǎn)入方法轉(zhuǎn)入動(dòng)物結(jié)果1980GordonHSV-TK小鼠78只子鼠中有2只為轉(zhuǎn)基因鼠1981Constantini兔珠蛋白基因小鼠24只子鼠中9只為轉(zhuǎn)基因鼠1982Palmiter將MT啟動(dòng)子與大鼠GH基因接成得融合基因侏儒小鼠7只轉(zhuǎn)基因中1只生長加快,明顯增大1985Wagner拼接有NEO基因得逆轉(zhuǎn)錄病毒小鼠獲得整合體小鼠1985Hammer制備轉(zhuǎn)基因兔、羊、豬均獲得成功1986RobertsonMPSA-mos-Neo逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ES細(xì)胞得到可遺傳得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1987Thomas利用ES細(xì)胞法結(jié)合同源重組技術(shù)小鼠制備出Hprt基因定點(diǎn)突變得轉(zhuǎn)基因小鼠1988Biery牛轉(zhuǎn)基因牛成功1990Hochi大鼠轉(zhuǎn)基因大鼠成功1994Love線性質(zhì)粒雞7只雞活到性成熟,1只公雞給后代傳遞外源基因1994Ono基因微注射鵪鶉有46、6%胚體表達(dá)了外源基因1998Wilmut綿羊乳腺細(xì)胞綿羊體細(xì)胞核克隆,獲得綿羊“多利”10大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了,稍作休息大家有疑問得,可以詢問與交流年份單位及研究者基因/轉(zhuǎn)入方法轉(zhuǎn)入動(dòng)物結(jié)果1984發(fā)育所陸德裕等人珠蛋白小鼠個(gè)體大,基因可連續(xù)傳遞,但表型似不能保持1986發(fā)育所史瀛仙等牛及人生長激素小鼠DNA能轉(zhuǎn)錄成RNA得小鼠體型大,未能轉(zhuǎn)錄成RNA得小鼠體積小,說明基因在體內(nèi)一定要轉(zhuǎn)錄成RNA,并翻譯成蛋白質(zhì),才能起促進(jìn)生長得作用。1987發(fā)育所于建康等大腸桿菌galk基因小鼠產(chǎn)21只,2只DNA中含有大腸桿菌galk基因1995北京農(nóng)大陳永福等ZPL線性化得DNA導(dǎo)入豬受精卵豬獲轉(zhuǎn)基因豬,為避免豬過早死亡,采用傳代、后誘導(dǎo)表達(dá)法1996中國農(nóng)科院畜牧所黃少華等微注射SMT-PGH基因到豬早期胚胎豬妊娠率隨移入胚胎數(shù)得增多而提高,以20-30為宜1997江蘇農(nóng)科院范必勤等用體外獲能得精子為載體,通過體外受精導(dǎo)入基因豬建立新得基因?qū)敕椒?998上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所曾溢滔等人凝血因子山羊產(chǎn)出5只轉(zhuǎn)基因羊,其中1只母羊乳汁中含有人凝血因子1999上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所曾溢滔等人血清蛋白奶牛移植8頭牛,妊娠3頭,生產(chǎn)1頭公牛,攜帶有人血清蛋白基因國內(nèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物首創(chuàng)記錄

⑴經(jīng)典得技術(shù)路線

先從已交配得供體動(dòng)物得輸卵管中采取受精卵;顯微注射法向受精卵得雄性核導(dǎo)入人工構(gòu)建得藥物蛋白基因;經(jīng)外科手術(shù)把已導(dǎo)入外源基因得受精卵移入同步發(fā)情得受體母羊輸卵管內(nèi);讓受精卵在“養(yǎng)母”體發(fā)育至分娩出生;用分子生物學(xué)技術(shù)檢測出生小羊就是否已整合了導(dǎo)入得外源基因。該法得缺點(diǎn):實(shí)驗(yàn)周期長,注射得外源基因整合率低。3、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得技術(shù)路線⑵整合胚胎移植技術(shù)路線

該技術(shù)就是對前種方法得改進(jìn)。它利用了生殖技術(shù)中得體外受精技術(shù),使精子與卵子在體外受精;然后找到一個(gè)最佳時(shí)機(jī)向體外受精得細(xì)胞顯微注射藥物蛋白基因。然后在體外對胚胎體進(jìn)行整合得鑒定。從中挑選有目得基因整合得胚胎進(jìn)行移植。采用經(jīng)陰道得非手術(shù)胚胎移植法,減少了對受精卵得損傷。⑶核移植(克隆)技術(shù)路線

利用克隆技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。即在進(jìn)行克隆之前,先目得基因注射到將進(jìn)行移植得核中,在按克隆技術(shù)進(jìn)行操作。其成功率比經(jīng)典技術(shù)路線高2、5倍。⑷整合卵受精技術(shù)路線

即在受精之前先將藥物蛋白基因注射進(jìn)入卵細(xì)胞,經(jīng)檢測已經(jīng)完成整合后,再進(jìn)行體外受精與胚胎移植。A、互補(bǔ)DNA(cDNA)得克隆

通過提取組織中得mRNA,用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,建立cDNA文庫,再克隆目標(biāo)蛋白得cDNA。由于cDNA缺乏內(nèi)含子,影響基因?qū)牒蟮帽磉_(dá)效率。B、DNA克隆

首先建立動(dòng)物得DNA文庫,再通過基因克隆技術(shù)獲得編碼目標(biāo)蛋白得基因,這就是獲得目標(biāo)基因最常用得方法。目標(biāo)基因被克隆以后需與表達(dá)載體相連結(jié),形成一個(gè)獨(dú)立表達(dá)得調(diào)控單元,再通過擴(kuò)增與純化,使DNA達(dá)到一定濃度就可用于基因?qū)胧荏w。目前獲得目標(biāo)基因得途徑有兩種方法:基因?qū)氲梅椒?/p>

A、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法(retrovirusinfection)B、顯微注射法(microinjection)C、胚胎干細(xì)胞法(EScelltransfermethod)D、精子載體法(Sperm-mediatedgenetransfer)E、生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法(Germcelltransfected)F、細(xì)胞核移植法(Cellnucleartransfer)A、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法

反轉(zhuǎn)錄病毒就是雙鏈RNＡ病毒,它侵染細(xì)胞后可通過自身得反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板在寄主細(xì)胞染色體中反轉(zhuǎn)錄成DNA。在利用病毒載體轉(zhuǎn)基因時(shí),首先要對病毒基因組進(jìn)行改造,將外基因插入到病毒基因組致病區(qū),然后用此病毒感染胚胎細(xì)胞,即可對胚胎細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因組中,可獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,在第一次卵裂之后整合,會(huì)產(chǎn)生嵌合體,其第二代可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)點(diǎn):方法簡單,效率高,外源DNA在整合時(shí)不發(fā)生重排,單位點(diǎn)、單拷貝整合,并且不受胚胎發(fā)育階段得限制。缺點(diǎn):攜帶外源基因得長度不超過15kb,載體病毒基因有潛在致病性,威脅受體動(dòng)物得健康安全。B、顯微注射法(microinjection)

C、胚胎干細(xì)胞法

這種方法首先就是用外源基因轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞,通過篩選,把陽性細(xì)胞注入受體動(dòng)物得囊胚腔中,生產(chǎn)嵌合體動(dòng)物,當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化為生殖干細(xì)胞時(shí)外源基因可通過生殖細(xì)胞遺傳給后代,在第二代獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)點(diǎn):對陽性細(xì)胞進(jìn)行選擇,實(shí)現(xiàn)外源DNA得定點(diǎn)整合。缺點(diǎn):第一代就是嵌合體,獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得周期較長。D、精子載體法

它就是利用哺乳動(dòng)物得精子能結(jié)合外源DNA得特性,通過受精過程把外源DNA導(dǎo)入受精卵,獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)點(diǎn):方法簡單,轉(zhuǎn)基因效率高。缺點(diǎn):效果不穩(wěn)定,外源DNA分子可能會(huì)受到受精液中內(nèi)切酶得作用而影響整合后得功能。E、生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法

F、細(xì)胞核移植法

這種方法就是隨著哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)得發(fā)展而建立得。首先用外源DNA對培養(yǎng)得體細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞進(jìn)行傳染,然后選擇陽性細(xì)胞作核供體,通過細(xì)胞核移植,獲得基因動(dòng)物。這種方法就是非常理想得轉(zhuǎn)基因手段,因?yàn)樗膳c基因靶技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)外源基因得定點(diǎn)整合,消除外源DNA隨機(jī)整合帶來得負(fù)作用。這種方法得轉(zhuǎn)基因效率可達(dá)100%,大大降低轉(zhuǎn)基因家畜得生產(chǎn)成本。檢測得方法A、外源基因得整合檢測它就是檢測動(dòng)物基因組中就是否攜帶外源DNA。常用得方法就是用目標(biāo)基因得一段序列作引物,PCR儀擴(kuò)增目標(biāo)DNA,再通過電泳初步檢測就是否含有目標(biāo)基因。然后,用Southern雜交檢測PCR陽性個(gè)體就是否含有目標(biāo)基因,如果出現(xiàn)陽性,就可斷定為轉(zhuǎn)基因陽性動(dòng)物。B、外源基因得轉(zhuǎn)錄檢測它就是用Northern雜交法對轉(zhuǎn)基因動(dòng)物某一組織得mRNA進(jìn)行分析檢測,出現(xiàn)陽性表明外源基因具有轉(zhuǎn)錄活性。C、外源基因得表達(dá)檢測它就是檢測轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中就是否含有目標(biāo)基因編碼得外源蛋白質(zhì),常用得方法有酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法與Western雜交法。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得應(yīng)用

在醫(yī)學(xué)上

A、制備動(dòng)物疾病模型與疾病相關(guān)得基因被克隆后,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備動(dòng)物疾病模型,可用來研究疾病得發(fā)生、發(fā)展規(guī)律與治療藥物得篩選,以此確定確定此疾病得最佳治療方案。目前,在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)人類得遺傳疾病有3500多種,已建立約15種轉(zhuǎn)基因疾病模型,其中包括糖尿病、高血脂癥、β－地中海或鐮刀型貧血癥,阿爾茨海默氏病(Alzheimer’sDisease),動(dòng)脈粥樣硬化癥等常見得疾病。B、用以研究癌基因得活動(dòng)規(guī)律與腫瘤得發(fā)生機(jī)理。如SV40得啟動(dòng)子與胰島素或晶狀體蛋白基因重組后,制備得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出現(xiàn)胰腺瘤或晶狀體瘤,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SV40啟動(dòng)子得72個(gè)核苷酸與腫瘤得發(fā)生有密切關(guān)系,已建立乳腺癌與前列腺癌得小鼠。C、用以治療遺傳疾病隨著人類基因組計(jì)劃得完成與基因定點(diǎn)整合技術(shù)得成熟,轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能治愈人類得遺傳疾病。D、生產(chǎn)人得代用器官用表達(dá)病人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因或敲除細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原決定簇基因豬得器官可替代人得患病器官,延長病人得壽命。家蠶篇轉(zhuǎn)基因家蠶所用載體轉(zhuǎn)基因載體就是一類裝載有外源DNA并使其隨自身復(fù)制而得到擴(kuò)增得DNA構(gòu)造,并且具有可以將所攜帶得外源基因在一定條件下插入到宿主基因組中得功能,轉(zhuǎn)基因載體包括一些固有得元件,如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)座序列等,進(jìn)行家蠶轉(zhuǎn)基因操作,除了應(yīng)注意目得基因得導(dǎo)入方法與導(dǎo)入時(shí)期外,選擇合適得啟動(dòng)子與構(gòu)建合適類型得載體也就是技術(shù)得關(guān)鍵。轉(zhuǎn)基因家蠶載體中所用啟動(dòng)子選擇合適得啟動(dòng)子也就是成功表達(dá)外源基因得關(guān)鍵因素之一,啟動(dòng)子就是位于一個(gè)基因上游得一段DNA序列,它含有蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶)得結(jié)合位點(diǎn),目前家蠶轉(zhuǎn)基因多采用家蠶體內(nèi)廣泛存在得肌動(dòng)蛋白A3啟動(dòng)子與多角體病毒極早期蛋白E1啟動(dòng)子。基于轉(zhuǎn)座子得載體目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因家蠶研究最多得就是piggyBac轉(zhuǎn)座子,它也就是昆蟲生殖系轉(zhuǎn)化使用最廣泛得轉(zhuǎn)座子,piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)常作為家蠶轉(zhuǎn)基因研究采用得有效載體,piggyBac轉(zhuǎn)座子得結(jié)構(gòu)基于病毒得載體:

用于家蠶基因工程得桿狀病毒主要有家蠶核型多角體病毒(BmNPV)與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV),既可用于家蠶得種系轉(zhuǎn)移,又可用于瞬時(shí)表達(dá),該方法就是將外源基因插入到桿狀病毒特定位點(diǎn),得到重組病毒,通過重組病毒與家蠶基因組之間得同源重組將外源基因整合到家蠶基因組。基因打靶載體

基因打靶技術(shù)以同源重組為基礎(chǔ),通過同源重組將外源基因定向地融合進(jìn)靶細(xì)胞基因組中得某個(gè)位點(diǎn),自20世紀(jì)80年代后興起,人為地對某一預(yù)先確定得靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,可以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因得目得。與piggyBac轉(zhuǎn)座子相比,其突出得優(yōu)點(diǎn)就是克服了隨機(jī)整合得盲目性與危險(xiǎn)性,因此就是一種理想得修飾與改造生物遺傳物質(zhì)得方法。關(guān)于家蠶-基因?qū)氲梅椒?/p>

A、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法(retrovirusinfection)B、顯微注射法(microinjection)C、胚胎干細(xì)胞法(EScelltransfermethod)D、精子載體法(Sperm-mediatedgenetransfer)E、生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法(Germcelltransfected)F、細(xì)胞核移植法(Cellnucleartransfer)轉(zhuǎn)基因家蠶得應(yīng)用研究

研究基因功能:在家蠶得全基因組框架圖完成之后,目前得主要工作就是對家蠶基因組計(jì)劃所獲得得大量基因進(jìn)行研究,以探索其具體得生物學(xué)功能,由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)家蠶功能基因得過量表達(dá)或者基因功能得缺失,因此將成為研究家蠶基因功能得重要方法之一。要最終鑒定基因功能,最理想得方法就是將分離得基因?qū)爰倚Q體內(nèi),在個(gè)體水平上驗(yàn)證其就是否具有功能,特別就是對于功能基因組學(xué)研究來說,不僅要確定序列得編碼區(qū)與非編碼區(qū),還要鑒定相關(guān)得生物功能,因此只有轉(zhuǎn)基因方法才能最終使我們認(rèn)識所有不同序列得功能特征,轉(zhuǎn)基因家蠶有助于研究家蠶系統(tǒng)發(fā)育調(diào)控以及基因群得相互作用。研究基因得表達(dá)機(jī)制:

將家蠶基因得啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列與lacZ融合基因做成轉(zhuǎn)基因家蠶,通過調(diào)查lacZ基因得表達(dá),研究基因得表達(dá)機(jī)制。不同得蠶品種,其內(nèi)部生理環(huán)境各不相同,生化代謝與調(diào)控也存在一定得差異,因此以不同品種得家蠶為對象進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究,所獲得得轉(zhuǎn)基因蠶中外源基因