從業人員健康檢查第4部分：Part4:DetectionmethodsofSalmonellatyphimurium,Sa2025-02-21發布2025-03-21實施江蘇省市場監督管理局Ⅰ前言 Ⅲ引言 Ⅳ 2規范性引用文件 3術語和定義 4縮略語 5方法原理 6設備與材料 7培養基和試劑 8檢驗程序 9操作步驟 10生物安全 附錄A（資料性）培養基和試劑 附錄B（規范性）實時熒光PCR檢測反應體系及注意事項 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件是DB32/T4644《從業人員健康檢查》的第4部分。DB32/T4644已經發布了以下部分：——第1部分：檢查機構管理規范；——第2部分：健康檢查技術規范；——第3部分：質量控制規范；——第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗方法；——第5部分：信息系統基本數據集。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省衛生健康委員會提出并組織實施。本文件由江蘇省衛生健康標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、南京市疾病預防控制中心、徐州市疾病預防控制中心、深圳市職業病防治院、赤峰眾康生物科技有限公司。苗升浩。Ⅳ引言從業人員健康檢查是根據《中華人民共和國傳染病防治法》《中華人民共和國食品安全法》《中華人民共和國藥品管理法》《公共場所衛生管理條例》《生活飲用水衛生監督管理辦法》《化妝品衛生管理條例》等法律法規所進行的從業前、從業期間的健康檢查。DB32/T4644《從業人員健康檢查》分為以下5個部分：——第1部分：檢查機構管理規范；——第2部分：健康檢查技術規范；——第3部分：質量控制規范；——第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗方法；——第5部分：信息系統基本數據集。DB32/T4644的制定是對從業人員健康檢查工作相關國家標準、行業標準的有力補充，對貫徹落實《“健康中國2030”規劃綱要》、推進健康中國建設、提高人民健康水平、保障公眾健康和公共衛生安全具有重要意義。DB32/T4644.4—20251從業人員健康檢查第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗方法本文件描述了從業人員健康檢查糞便標本（肛拭子）中傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的檢驗方法。本文件適用于公共場所從業人員、食品生產和加工人員、食品流通和餐飲服務人員、飲用水生產、經營人員健康檢查項目中糞便標本（肛拭子）的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的檢驗，醫療衛生用品、化妝品等相關行業從業人員的健康檢查可參照執行。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.4食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗GB19489實驗室生物安全通用要求WS280傷寒和副傷寒診斷標準WS287細菌性和阿米巴性痢疾診斷標準WS289霍亂診斷標準3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1實時熒光PCRreal?timePCR實時熒光聚合酶鏈式反應。3.2Ct值cyclethreshold每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。4縮略語BS：亞硫酸鉍瓊脂（BismuthSulfiteAgar）CY5：磺酸基?CY5羧酸（Cyanine5）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）FAM：6?羧基熒光素（6?carboxyfluorescein）DB32/T4644.4—20252LDC：賴氨酸脫羧酶（LysineDecarboxylase）MAC：麥康凱瓊脂（MacConkeyAgar）NB：營養肉湯（NutrientBroth）NP?40：乙基苯基聚乙二醇（NonidetP?40）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TCBS：硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖瓊脂（TCBSAgar）TSI：三糖鐵瓊脂（TripleSugarIronAgar）UNG酶：尿嘧啶DNA糖基酶（UracilDNAglycosylase）VIC：琥珀酰亞胺酯（FluoresceinAmidite）XLD：木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（Xylose?LysineDesoxycholateAgar）5方法原理5.1篩查試驗5.1.1依據核酸體外擴增基本原理，針對傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴特異靶基因序列設計引物和熒光標記探針，在實時熒光PCR反應過程中，當熒光信號達到并超過所設定的閾值時，利用熒光信號強度與PCR產物量的正相關關系，即可對實時熒光PCR結果進行分析和判定。5.1.2對標本的模板DNA進行實時熒光PCR擴增，根據其Ct值及擴增曲線進行標本結果報告，當實時熒光PCR結果呈陰性時直接報告陰性結果；當實時熒光PCR結果呈陽性時，進一步對陽性標本做確證試驗。從而實現對從業人員健康檢查糞便標本（肛拭子）中的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的快速篩查。5.2確證試驗通過增菌、分離、生化和血清學鑒定等方法，從實時熒光PCR陽性標本中分離得到目標病原體。結果為陽性時報告陽性（檢出結果為陰性時報告陰性（未檢出）。6設備與材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，包括但不限于以下設備和材料。6.1Ⅱ級生物安全柜。6.2冰箱：2℃~8℃和-20℃。6.3恒溫培養箱：36℃±1℃、37℃±1℃、42℃±1℃。6.4電子天平：分度值為0.1g和0.01g。6.5離心機：離心力≥12000×g。6.6pH計或pH比色管或精密pH試紙。6.7渦旋混勻器。6.8恒溫金屬浴/水浴鍋：25℃~100℃。6.9實時熒光PCR儀。DB32/T4644.4—202536.10全自動微生物生化鑒定系統。6.11微生物飛行質譜鑒定系統。6.12無菌錐形瓶：容量500mL、250mL。6.13無菌試管：10mm×75mm、15mm×150mm或其他合適規格。6.14無菌小玻管：3mm×50mm。6.15無菌培養皿：直徑90mm。6.17微量可調移液器和配套帶濾芯吸頭：2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。6.18采樣管：密閉式。6.19采樣拭子：長度≥10cm。6.20PCR反應管。7培養基和試劑7.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：見A.2。7.3氯化鎂孔雀綠大豆胨（RVS）增菌液：見A.3。7.4堿性蛋白胨水培養基：見A.4。7.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：見A.7。7.9慶大霉素瓊脂：見A.9。7.10硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖（TCBS）瓊脂：見A.10。7.12堿性營養瓊脂：見A.12。7.15糖發酵培養基：見A.15。7.16氧化酶試劑：見A.16。7.17賴氨酸脫羧酶（LDC）試驗培養基：見A.17。7.18動力?靛基質?尿素半固體（MIU）瓊脂：見A.18。7.19沙門氏菌顯色培養基。7.20沙門氏菌診斷血清。7.21志賀氏菌診斷血清。7.22霍亂弧菌診斷血清。7.23除特別說明外，PCR所用化學試劑為分析純。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。7.24DNA提取液：Tris?EDTA緩沖液（0.01mol/L，pH8.0）、0.01%NP40。7.25實時熒光PCR檢測試劑：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光PCR檢測靶基因、反應體系及注意事項應符合附錄B。48檢驗程序傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗程序見圖1。FKFK88FF1$3K81$3K81$31$3K+*K11$3K+*K11$3K!K!8!K!8L81$3KB!81$3K881J1J..*G*GN=BA=#+*K1!K!8!K!8B!8L8+*K1+*+*K1!K!8!K!8B!8L8+*K1+*K1!K!8!K!8B!8L8!K!8!K!8!K!8B!8L8圖1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗程序9操作步驟9.1標本采集、保存及運輸用滅菌的采樣拭子，由肛門插入直腸內3cm~5cm處，旋轉360°采集，或用采樣拭子蘸取適量糞便，5放入盛有1mL~3mL生理鹽水的采樣管內，旋緊管蓋，編號備用。9.1.2標本的保存和運輸采集的標本盡快運送到實驗室進行檢測，如不能立即送檢，在2℃~8℃條件下保存不超過24h。9.2標本的前處理將標本充分混勻，吸取勻液1mL加入到4mL營養肉湯中，置于36℃±1℃增菌培養3h~6h。9.2.2標本混合9.2.2.1根據樣本數量，取n個無菌的1.5mL離心管或合適容量篩選管作為混合管，分別編號。9.2.2.2每份標本取增菌液100μL，分別依次加入到混合管中。根據實際情況，將5~10份標本混合成1份混合標本。9.2.2.3標本混合時，應防止操作人員和環境污染。混合完成后，使用渦旋振蕩器進行混勻，再進行實時熒光PCR檢測。9.2.2.4如混合標本PCR檢測為陰性，判定混合標本所代表的全部標本為陰性。如混合標本PCR檢測為某種致病微生物陽性，則再對混合標本中的每一份標本按9.4進行確證試驗，以確定具體陽性標本。9.3篩查試驗9.3.1DNA模板的制備標本12000×g離心5min，棄上清；加入50μL~100μLDNA取液，重懸沉淀并充分混合后100℃加熱處理5min，12000×g離心2min，取5μL上清液，作為模板DNA用于實時熒光PCR檢測。若不能及時檢測，應存放于-20℃以下保存，并盡快完成檢測。根據實驗室實際情況，也可使用商品化試劑盒制備DNA模板。9.3.2PCR反應體系總反應體系體積為25μL：PCR反應液20μL（含有特異性引物、dNTP、探針及反應所需各種離子19.64μL，1U/μLUNG酶0.06μL，5U/μLTaq酶0.3μL模板DNA5μL。反應體系按照附錄B執行。9.3.3實時熒光PCR檢測9.3.3.1將9.3.2中瞬時離心后的PCR反應管放入實時熒光PCR儀內，記錄標本擺放順序，進行核酸擴增和檢測。（同時采集FAM、VIC和CY5熒光信號進行40個循環。9.3.4對照設置檢測過程（包括DNA提取）中，每個反應均應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。其中陽性對照模板為擴增片段的陽性克隆分子DNA或標準菌株DNA，陰性對照模板為大腸埃希氏菌標準菌株DNA，空白對照為滅菌去離子水。69.3.5結果判讀9.3.5.1對照的結果判讀陽性對照出現典型擴增曲線，Ct值≤30；陰性對照無典型擴增曲線或Ct值≥40；空白對照無典型擴增曲線或Ct值≥40。否則，此次實驗結果視為無效。9.3.5.2樣品的結果判定和報告9.3.5.2.1FAM通道Ct值>40或無Ct值，可判定標本檢測結果為傷寒沙門氏菌（A管）和（或）痢疾阿米巴（B管）陰性，可直接報告未檢出傷寒沙門氏菌和（或）痢疾阿米巴；VIC通道Ct值>40或無Ct值，可判定標本檢測結果為副傷寒沙門氏菌（A管）陰性，可直接報告未檢出副傷寒沙門氏菌；CY5通道Ct值>40或無Ct值，可判定標本檢測結果為霍亂弧菌（A管）和（或）志賀氏菌（B管）陰性，可直接報告未檢出霍亂9.3.5.2.2FAM通道Ct值<35，有明顯指數增長期，可判定該標本檢測結果為傷寒沙門氏菌（A管）和（或）痢疾阿米巴（B管）陽性；VIC通道Ct值<35，有明顯指數增長期，可判定該標本檢測結果為副傷寒沙門氏菌（A管）陽性；CY5通道Ct值<35，有明顯指數增長期，可判定該標本檢測結果為霍亂弧菌（A管）表1檢測結果判定表FAMVICCY5A管傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌霍亂弧菌B管痢疾阿米巴—志賀氏菌9.3.5.2.3FAM通道、VIC通道和（或）CY5通道35≤Ct值≤40，重新做實時熒光PCR檢測。若重新檢測結果的Ct值≥40，則判定為相應病原體陰性，否則判定為陽性。9.3.5.2.4如用商品化實時熒光PCR試劑盒，應按照試劑盒說明書進行檢測和結果判定。9.3.5.3PCR陽性混合標本確認對PCR結果為陽性的混合標本，依據9.4確證試驗做進一步的確認。9.4確證試驗9.4.1.1混合標本實時熒光PCR檢測結果為傷寒沙門氏菌或副傷寒沙門氏菌陽性時，將混合前的所有個標本分別接種于RVS增菌液中42℃±1℃培養18h~24h，同時接種TTB增菌液中42℃±1℃培養9.4.1.2混合標本實時熒光PCR檢測結果為志賀氏菌陽性時，無須增菌，將混合前的所有單個標本直接分別分離培養。9.4.1.3混合標本實時熒光PCR檢測結果為霍亂弧菌陽性時，將混合前的所有單個標本分別接種于堿性蛋白胨水培養基中36℃±1℃增菌培養6h~8h。79.4.2分離培養9.4.2.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌：按照GB4789.4進行檢測。9.4.2.2志賀氏菌：取前增菌液1環，劃線接種于MAC或XLD瓊脂平板，于36℃±1℃培養18h~24h，志賀氏菌呈現不發酵乳糖的菌落，見表2。表2志賀菌屬在MAC和XLD瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板志賀氏菌MAC瓊脂落較大，不透明，培養時間稍長易形成淡粉紅色、扁平的粗糙菌落XLD瓊脂紅色透明狀、表面光滑、濕潤、隆起、邊緣整齊的菌落9.4.2.3霍亂弧菌：取增菌液1環，劃線接種于強、弱選擇性培養基各一塊置37℃培養18h~24h。強選擇性培養基包括慶大霉素瓊脂、TCBS瓊脂和四號瓊脂，弱選擇性培養基一般使用堿性營養瓊脂。霍亂弧菌在選擇性培養基上的菌落特征見表3。表3霍亂弧菌在選擇性培養基上的菌落特征選擇性瓊脂平板霍亂弧菌堿性營養瓊脂無色、圓形、透明或半透明、表面光滑、潤濕、扁平或稍凸起、邊緣整齊，菌落直徑一般約為慶大霉素瓊脂和四號瓊脂與堿性營養瓊脂上生長的菌落相似，但透明性略差，多呈半透明狀，由于這類培養基均含有亞碲酸鹽成分，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養時間的延長而加深TCBS瓊脂9.4.3菌株鑒定9.4.3.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌按照WS280進行檢測。可選擇生化鑒定試劑盒、全自動微生物生化鑒定系統或微生物飛行質譜鑒定系統進行鑒定。9.4.3.2志賀氏菌按照WS287進行檢測。可選擇生化鑒定試劑盒、全自動微生物生化鑒定系統進行鑒定。9.4.3.3霍亂弧菌按照WS289進行檢測。包括玻片凝集試驗和氧化酶試驗。9.4.3.3.2.1經初篩陽性或可疑陽性的菌株，應該進行復核鑒定。按照WS289進行檢測。可選擇生化鑒定試劑盒、全自動微生物生化鑒定系統或微生物飛行質譜鑒定系統。89.4.3.3.2.2復核結果符合O1群或O139群霍亂弧菌的菌株，按菌株管理的要求保存與上送；如復核結果出現疑問，應盡快將菌株上送參比實驗室進行確認分析。9.4.4血清學分型傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、志賀氏菌采用玻片凝集試驗。一般采用瓊脂含量為1.2%~1.5%的純培養物進行玻片凝集試驗。首先用生理鹽水進行自凝性檢測。若菌體在生理鹽水中凝集，即認為有自凝性，反之無自凝性。對無自凝的培養物參照下面方法進行血清學鑒定。9.4.4.2傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌血清分型按照WS280進行檢測。9.4.4.3志賀氏菌血清分型按照WS287—2008中A.1進行檢測。9.4.5痢疾阿米巴檢驗PCR檢測結果為痢疾阿米巴陽性時，需重新采集病人糞便，按照WS287—2008中A.2進行檢測。9.5結果報告根據確證試驗結果對實時熒光PCR陽性標本作出最終結果判定和菌型判定。10生物安全標本采集、轉運、保存和檢驗等活動，按照GB19489相關規定執行。9（資料性）培養基和試劑A.1營養肉湯蛋白胨牛肉膏氯化鈉蒸餾水將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25℃左右校正pH至7.4±0.2，分裝適當的容器。121℃滅菌A.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液蛋白胨牛肉浸粉氯化鈉碳酸鈣硫代硫酸鈉（含5個結晶水）牛膽鹽蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解。煮沸，無須高壓滅菌。煮沸后的培養基在25℃的pH為7.6±0.2。A.2.1.2碘溶液碘化鉀碘蒸餾水將碘化鉀溶解于少量的蒸餾水中，再加入碘，振搖至碘全部溶解。加蒸餾水至100mL，轉入棕色瓶內，塞緊瓶塞冷藏貯存。A.2.1.3煌綠溶液煌綠蒸餾水將煌綠在蒸餾水中溶解后，存放在冷暗處不少于1d。A.2.2制法使用的當天，在冷卻后的1000mL基礎液中以無菌操作加入煌綠溶液2.0mL搖勻，加入碘溶液20.0mL，再搖勻，分裝到無菌試管中。加入煌綠和碘液的培養基當天使用，且不應再次加熱。A.3氯化鎂孔雀綠大豆胨（RVS）增菌液大豆蛋白胨氯化鈉磷酸二氫鉀磷酸氫二鉀氯化鎂（含6個結晶水）孔雀綠蒸餾水A.3.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH，定量分裝于試管中，115℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養基在25℃的pH為5.2±0.2。A.4堿性蛋白胨水培養基蛋白胨氯化鈉蒸餾水A.4.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。分裝，121℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養基在25℃的pH為8.6±0.2。蛋白胨牛肉浸粉葡萄糖硫酸亞鐵磷酸氫二鈉煌綠檸檬酸鉍銨亞硫酸鈉瓊脂蒸餾水A.5.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養基在25℃的pH為7.5±0.2。注：本培養基于臨用前一天制備并傾注平皿，在室溫暗處保存，第二天使用。制備完成的培養基保存時間超過48h會降低其選擇性。DB32/T4644.4—202512A.6HE瓊脂A.6.1成分蛋白胨牛肉浸粉乳糖蔗糖水楊苷膽鹽氯化鈉硫代硫酸鈉檸檬酸鐵銨脫氧膽酸鈉酸性品紅溴麝香草酚藍瓊脂蒸餾水12.0g3.0g12.0g12.0g2.0g20.0g5.0g6.8g0.8g2.0g0.1g0.064g18.0g1000mLA.6.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養基在25℃的pH為7.5±0.2。A.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂A.7.1成分酵母浸粉L?賴氨酸木糖乳糖蔗糖脫氧膽酸鈉檸檬酸鐵銨硫代硫酸鈉氯化鈉酚紅瓊脂蒸餾水3.0g5.0g3.75g7.5g7.5g2.5g0.8g6.8g5.0g0.08g15.0g1000mLA.7.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養基在25℃的pH為7.4±0.2。蛋白胨乳糖3號膽鹽氯化鈉中性紅結晶紫瓊脂蒸餾水A.8.2制法48℃±2℃,傾注平板，滅菌后的培養基在25℃的pH為7.2±0.2。A.9慶大霉素瓊脂蛋白胨牛肉粉氯化鈉蔗糖枸櫞酸鈉亞硫酸鈉多黏菌素B慶大霉素亞碲酸鉀瓊脂蒸餾水DB32/T4644.4—202514A.9.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌，冷卻至55℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養基在25℃的pH為8.4±0.2。A.10硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖（TCBS）瓊脂A.10.1成分蛋白胨酵母浸膏檸檬酸鈉（C6H5O7Na3·2H2O）硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）氯化鈉牛膽汁粉檸檬酸鐵膽酸鈉蔗糖溴麝香草酚藍麝香草酚藍瓊脂蒸餾水10.0g5.0g10.0g10.0g10.0g5.0g1.0g3.0g20.0g0.04g0.04g15.0g1000mLA.10.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌，冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養基在25℃的pH為8.6±0.2。A.11四號瓊脂A.11.1成分蛋白胨牛肉膏粉氯化鈉無水亞硫酸鈉十二烷基硫酸鈉雷佛奴爾豬膽汁粉20.0g5.0g5.0g3.0g0.5g0.03g5.0g慶大霉素瓊脂蒸餾水將各成分溶于蒸餾水中，校正pH至8.5±0.2，加熱煮沸至完全溶解。冷至50℃左右，每100mL加入0.1mL通過0.22μm孔徑濾膜進行過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，搖勻，傾注平板。A.12堿性營養瓊脂蛋白胨牛肉粉氯化鈉瓊脂蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，必要時調節pH。分裝后121℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養基在25℃的pH為8.4±0.2。蛋白胨牛肉浸粉乳糖蔗糖葡萄糖酚紅氯化鈉硫酸亞鐵銨（含6個結晶水）硫代硫酸鈉瓊脂蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。定量分裝于試管中，115℃高壓滅菌15min。滅菌后制成斜面，底層深度不小于2.5cm。滅菌后的培養基在25℃的pH為7.4±0.2。蛋白胨牛肉膏酵母膏山梨醇葡萄糖氯化鈉檸檬酸鐵銨硫代硫酸鈉瓊脂酚紅蒸餾水將酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，校正pH至7.4±0.2，加入0.2%的酚紅溶液12.5mL，搖勻，分裝試管，裝量宜多些，以便得到比較高的底層，121℃高壓滅菌15min，放置高層斜面備用。A.15糖發酵培養基蛋白胨牛肉浸粉氯化鈉磷酸氫二鈉（含12個結晶水）溴麝香草酚藍溶液蒸餾水17A.15.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH，121℃高壓滅菌15min。冷卻后加入終濃度為0.5%~1%的無水糖溶液，分裝。滅菌后的培養基在25℃的pH為7.4±0.2。A.15.3試驗方法挑取少量培養物接種于糖發酵管36℃±1℃培養24h~48h，觀察結果。培養基變為黃色者為陽性。對于培養48h后，懷疑為乳糖遲緩發酵者，可繼續培養至3d~5d再觀察結果。A.16氧化酶試劑A.16.1成分N，N，N'，N'?四甲基對苯二胺鹽酸鹽蒸餾水1.0g100.0mLA.16.2制法將N，N，N'，N'?四甲基對苯二胺鹽酸鹽溶于蒸餾水中，2℃~5℃冰箱內避光保存，在7d之內使用。A.16.3試驗方法用細玻璃棒或一次性接種針挑取新鮮（24h）菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙上。如果濾紙在10s之內呈現粉紅或紫紅色，即為氧化酶試驗陽性。不變色為氧化酶試驗陰性。A.17賴氨酸脫羧酶試驗培養基A.17.1成分蛋白胨酵母浸粉葡萄糖溴甲酚紫蒸餾水L?賴氨酸或DL?賴氨酸5.0g3.0g1.0g0.02g1000mL5.0g或10.0gA.17.2制法除賴氨酸以外的成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，加入L?賴氨酸或DL?賴氨酸，對照培養基不加賴氨酸。必要時調節pH。分裝后115℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養基在25℃的pH為6.8±0.2。A.17.3試驗方法挑取培養物接種于賴氨酸脫羧酶試驗培養基，混勻后滴加一層無菌液體石蠟進行密封。36℃±1℃DB32/T4644.4—202518培養18h~24h，觀察結果。培養基呈紫色者為賴氨酸脫羧酶陽性，培養基呈黃色者為賴氨酸脫羧酶陰性。對照管應為黃色。A.18動力?靛基質?尿素半固體（MIU）瓊脂A.18.1成分蛋白胨酪胨磷酸二氫鉀氯化鈉酚紅瓊脂蒸餾水28.0g2.0g1.0g5.0g0.005g4.0g1000mLA.18.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時調節pH。121℃高壓滅菌15min，冷卻至55℃,無菌加入40%的尿素溶液50mL，混勻后分裝試管備用。A.18.3試驗方法挑取培養物穿刺接種MIU半固體2/3深度，36℃±1℃培養18h~24h，觀察結果。在MIU管內，細菌沿穿刺線擴散生長為動力陽性，僅沿穿刺線生長為動力陰性；穿刺部分呈紅色為尿素酶陽性，否則為陰性；加入0.5mL靛基質試劑于MIU表面，數分鐘后上層呈深紅色或玫瑰紅色為陽性，否則為陰性。DB32/T4644.4—202519（規范性）實時熒光PCR檢測反應體系及注意事項B.1熒光PCR檢測靶基因分別針對傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿