第五章大腸桿菌基因工程第五章大腸桿菌基因工程1大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌得特征大腸桿菌表達(dá)外源基因得劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)得復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)得修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確得異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多得內(nèi)毒素2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)得原理啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)啟動(dòng)子啟動(dòng)子最佳距離得探測(cè)目得基因EEAEE啟動(dòng)子A酶切開(kāi)Bal31酶解目得基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子得篩選AprorigalKpKO1終止密碼子采用鳥(niǎo)槍法戰(zhàn)略,將合適大小得DNA片段克隆到啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pKO1上受體細(xì)胞染色體DNA上得galE、galT與質(zhì)粒上報(bào)告基因galk得表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用,可將培養(yǎng)基中得半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-得大腸桿菌受體菌株含有外源啟動(dòng)子活性得重組克隆啟動(dòng)子啟動(dòng)子得構(gòu)建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動(dòng)子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac啟動(dòng)子啟動(dòng)子得可控性P乳糖啟動(dòng)子Plac得可控性:OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)野生型得Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起,在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí),整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá);誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)得轉(zhuǎn)錄大幅提高啟動(dòng)子啟動(dòng)子得可控性Plac乳糖啟動(dòng)子Plac得可控性:OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型得Plac上游附近擁有代謝激活因子(CAP)結(jié)合區(qū),cAMP激活CAP,CAP基底水平轉(zhuǎn)錄結(jié)合啟動(dòng)子控制區(qū),進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)得轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少,也能阻遏Plac介導(dǎo)得轉(zhuǎn)錄。因此,基因工程中使用得乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏得突變型,即PlacUV5CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子啟動(dòng)子得可控性Ptrp色氨酸啟動(dòng)子Ptrp得可控性:Otrp除去色氨酸色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物得阻遏,轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸基底水平轉(zhuǎn)錄或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA),便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常得細(xì)菌培養(yǎng)體系中,除去色氨酸就是困難得,因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)得目基因得表達(dá)色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白(IAA)OtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp啟動(dòng)子啟動(dòng)子得可控性l噬菌體啟動(dòng)子PlL得可控性:噬菌體啟動(dòng)子PL受CI阻遏蛋白阻遏,很難直接誘導(dǎo)控制。在基因工程中常使用溫度敏感型得cI突變基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃時(shí)失活脫落,PL便可介導(dǎo)目得基因得表達(dá)。但在大型細(xì)菌培養(yǎng)罐中迅速升溫非常困難,因此常使用一個(gè)雙質(zhì)粒控制系統(tǒng),用色氨酸間接控制目得基因表達(dá)PtrpABcI857PL目得基因阻遏作用PtrpABPL表達(dá)色氨酸終止子強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止得必要性外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子得控制下表達(dá),容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象,即RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近得DNA序列,形成長(zhǎng)短不一得mRNA混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物得產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因得表達(dá),其原因如下:轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng),RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需得時(shí)間就相應(yīng)增加,外源基因本身得轉(zhuǎn)錄效率下降;如果外源基因下游緊接有載體上得其它重要基因或DNA功能區(qū)域,如選擇性標(biāo)記基因與復(fù)制子結(jié)構(gòu)等,則RNA聚合酶在此處得轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒得復(fù)制及其它生物功能,甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒得不穩(wěn)定性;過(guò)長(zhǎng)得mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用得蛋白質(zhì),增加工程菌無(wú)謂得能量消耗;更為嚴(yán)重得就是,過(guò)長(zhǎng)得轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想得二級(jí)結(jié)構(gòu),從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物得翻譯效率大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜終止子強(qiáng)終止子得選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用得終止子就是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上得rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上得Tf。對(duì)于一些終止作用較弱得終止子,通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)得特殊結(jié)構(gòu),以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子也可以象啟動(dòng)子那樣,通過(guò)特殊得探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs得轉(zhuǎn)化子核糖體結(jié)合位點(diǎn)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中得高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)得頻率,而且在很大程度上還與mRNA得翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同得mRNA分子具有不同得翻譯效率,它們之間得差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯得起始效率主要由其5‘端得結(jié)構(gòu)序列所決定,稱(chēng)為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)核糖體結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素:位于翻譯起始密碼子上游得6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’,即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中得16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專(zhuān)一性結(jié)合,將mRNA定位于核糖體上,從而啟動(dòng)翻譯;翻譯起始密碼子,大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架得起始位點(diǎn),但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子;SD序列與翻譯起始密碼子之間得距離及堿基組成;基因編碼區(qū)5’端若干密碼子得堿基序列

核糖體結(jié)合位點(diǎn)得結(jié)構(gòu)核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)得影響SD序列得影響:一般來(lái)說(shuō),mRNA與核糖體得結(jié)合程度越強(qiáng),翻譯得起始效率就越高,而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA得堿基互補(bǔ)性,其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言,上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T,均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低

核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)得影響SD序列與起始密碼子之間得序列得影響:

SD序列下游得堿基若為AAAA或UUUU,翻譯效率最高;而CCCC或GGGG得翻譯效率則分別就是最高值得50%與25%。緊鄰AUG得前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響,對(duì)于大腸桿菌b-半乳糖苷酶得mRNA而言,在這個(gè)位置上最佳得堿基組合就是UAU或CUU,如果用UUC、UCA或AGG取代之,則酶得表達(dá)水平低20倍核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)得影響SD序列與起始密碼子之間得距離得影響:

SD序列與起始密碼子之間得精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后,翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中得P位,這就是翻譯啟動(dòng)得前提條件。在很多情況下,SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處,在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基,均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度得降低核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)得影響起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子得影響:大腸桿菌中得起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG與UUG三種起始密碼子,但其識(shí)別頻率并不相同,通常GUG為AUG得50%而UUG只及AUG得25%。除此之外,從AUG開(kāi)始得前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要,至少這一序列不能與mRNA得5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上得準(zhǔn)確定位目前廣泛用于外源基因表達(dá)得大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上,均含有與啟動(dòng)子來(lái)源相同得核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列,序列與間隔就是最佳得密碼子生物體對(duì)密碼子得偏愛(ài)性不同得生物,甚至同種生物不同得蛋白質(zhì)編碼基因,對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同,具有一定得偏愛(ài)性,其決定因素就是:生物基因組中得堿基含量在富含AT得生物(如單鏈DNA噬菌體fX174)基因組中,密碼子第三位上得U與A出現(xiàn)得頻率較高;而在GC豐富得生物(如鏈霉菌)基因組中,第三位上含有G或C得簡(jiǎn)并密碼子占90%以上得絕對(duì)優(yōu)勢(shì)密碼子與反密碼子相互作用得自由能中等強(qiáng)度規(guī)律細(xì)胞內(nèi)tRNA得含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少;如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多;密碼子密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)得影響由于原核生物與真核生物基因組中密碼子得使用頻率具有較大程大得差異性,因此外源基因尤其就是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯得一個(gè)重要因素就是密碼子得正確選擇。一般而言,有兩種策略可以使外源基因上得密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá):外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因密碼子密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)得影響按照大腸桿菌密碼子得偏愛(ài)性規(guī)律,設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜得相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子,重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中得高效表達(dá)均采用了這種方法外源基因全合成密碼子密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)得影響對(duì)于那些含有不與諧密碼子種類(lèi)單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大得外源基因而言,則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)得策略較為有利。例如,在人尿激酶原cDNA得412個(gè)密碼子中,共含有22個(gè)精氨酸密碼子,其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA,而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG與tRNAAGA得豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中得高效表達(dá),將大腸桿菌得這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)得質(zhì)粒上。由此構(gòu)建得大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)得制約作用同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝得影響目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用得表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝,質(zhì)粒得擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi),而此時(shí)正就是細(xì)菌生理代謝最旺盛得階段。質(zhì)粒分子得過(guò)度增殖以及其后目得基因得高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞得生長(zhǎng)代謝,進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒得不穩(wěn)定性以及目得基因宏觀表達(dá)水平得下降解決上述難題得一種有效策略就是將重組質(zhì)粒得擴(kuò)增納入可控制得軌道質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序得控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型得復(fù)制子pCP3PLMCSoriApr在28℃時(shí),每個(gè)細(xì)胞得質(zhì)粒拷貝數(shù)為60在42℃時(shí),拷貝數(shù)迅速增至300-600在此溫度下,受體細(xì)胞染色體上得CI基因表達(dá)得溫度敏感型阻遏蛋白失活因此,用一種手段同時(shí)控制質(zhì)粒拷貝數(shù)與基因得表達(dá)3大腸桿菌基因工程菌得構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白得表達(dá)分泌型異源蛋白得表達(dá)融合型異源蛋白得表達(dá)寡聚型異源蛋白得表達(dá)整合型異源蛋白得表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建包涵體型異源蛋白得表達(dá)包涵體及其性質(zhì)在某些生長(zhǎng)條件下,大腸桿菌能積累某種特殊得生物大分子,它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi),或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu),這種水不溶性得結(jié)構(gòu)稱(chēng)為包涵體(InclusionBodies,IB)。富含蛋白質(zhì)得包涵體多見(jiàn)于生長(zhǎng)在含有氨基酸類(lèi)似物培養(yǎng)基得大腸桿菌細(xì)胞中,由這些氨基酸類(lèi)似物所合成得蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性與生物功能,從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建得大腸桿菌工程菌大量合成非天然性得同源或異源蛋白質(zhì),后者在一般情況下也以包涵體得形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外,包涵體中還含有少量得DNA、RNA與脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源蛋白得表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目得蛋白得優(yōu)缺點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物得分離操作包涵體表達(dá)形式得優(yōu)點(diǎn):包涵體得水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片與細(xì)胞成分,菌體經(jīng)超聲波裂解后,直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在形成包涵體之后,大腸桿菌得蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白得穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體型異源蛋白得表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目得蛋白得優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式得缺點(diǎn):以包涵體形式表達(dá)得重組蛋白喪失了原有得生物活性,必須通過(guò)有效得變性復(fù)性操作,才能回收得到具有正確空間構(gòu)象(因而具有生物活性)得目標(biāo)蛋白,因此包涵體變復(fù)性操作得效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物得收率至關(guān)重要。然而,這也就是一個(gè)技術(shù)難題,尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中得Cys殘基數(shù)目較高時(shí),體外復(fù)性蛋白質(zhì)得成功率相當(dāng)?shù)?一般不超過(guò)30%包涵體型異源蛋白得表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目得蛋白得操作如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)(如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)),外源基因在大腸桿菌中表達(dá)得蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí),表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此,以包涵體形式表達(dá)目得基因操作得關(guān)鍵就就是選擇高表達(dá)得載體。事實(shí)上,這種高表達(dá)率也就是包涵體法得長(zhǎng)處所在包涵體型異源蛋白得表達(dá)包涵體得變性與復(fù)性操作C

共價(jià)修飾得蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性復(fù)性得動(dòng)力學(xué)原理:C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAgAgAgAgI

有效變復(fù)性過(guò)程中得中間狀態(tài)X

脫離有效變復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入集聚得中間狀態(tài)N

天然狀態(tài)得蛋白質(zhì)U

變性狀態(tài)得蛋白質(zhì)A集聚狀態(tài)得蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),集聚狀態(tài)與共價(jià)修飾得蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過(guò)程,因此永遠(yuǎn)成為無(wú)活性得蛋白質(zhì)。包涵體中得蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài),因此需要在體外進(jìn)行人工變性(解除共價(jià)修飾與驅(qū)散集聚體)復(fù)性操作包涵體型異源蛋白得表達(dá)包涵體得變性與復(fù)性操作包涵體得溶解與變性:包涵體得溶解與變性得主要任務(wù)就是拆開(kāi)錯(cuò)配得二硫鍵與次級(jí)鍵在人工條件下,使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性得試劑與條件包括:清洗劑SDS、正十二醇肌氨酸,廉價(jià),但影響復(fù)性與純化促溶劑鹽酸胍、尿素,前者昂貴,尿素便宜,但常被自發(fā)形成得氰酸鹽污染,后者能與多肽鏈中得氨基反應(yīng)混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用,溶解力增強(qiáng)極端pH廉價(jià),但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體型異源蛋白得表達(dá)包涵體得變性與復(fù)性操作包涵體得復(fù)性與重折疊(refolding):包涵體得復(fù)性與重折疊得主要任務(wù)就是:通過(guò)次級(jí)鍵得形成使蛋白質(zhì)復(fù)性將多肽鏈中被拆開(kāi)得游離巰基重新折疊包涵體型異源蛋白得表達(dá)包涵體得變性與復(fù)性操作包涵體得復(fù)性與重折疊(refolding):復(fù)性操作包涵體復(fù)性操作得方法包括:分段稀釋法,逐步降低變性劑得濃度,防止二次集聚得發(fā)生一步稀釋法,蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān),但集聚與濃度關(guān)系很大試劑添加法,精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法,氨基檸檬酸酐酰化,蛋白帶負(fù)電,抑制集聚產(chǎn)物隔離法,將變性得蛋白分子固定化,避免其相互碰撞分子伴侶法,GroEL、GroES、DnaK,固定化,共表達(dá)包涵體型異源蛋白得表達(dá)包涵體得變性與復(fù)性操作包涵體得復(fù)性與重折疊(refolding):二硫鍵形成在包涵體變性體系中,始終存在著還原劑,使多肽鏈中得巰基保持還原狀態(tài),防化學(xué)氧化法(A)需要電子受體,最廉價(jià)得電子受體為空氣,二硫鍵形成就是二硫鍵交換(B)需要還原型與氧化型谷胱甘肽(GSH與GSSG),二硫鍵止二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致嚴(yán)重得集聚。在變性操作結(jié)束后,這些游離型得巰基必須重新配對(duì)形成二硫鍵,此時(shí)多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵得方式主要有:隨機(jī)得,僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基得蛋白質(zhì)得重折疊形成相對(duì)特異,因此適用性較廣,重折疊效果好HSHSSS+2e+2H+AHSHSS-S-RHS+BR-S-S-RSS2R-SH分泌型異源蛋白得表達(dá)在大腸桿菌中表達(dá)得異源蛋白按其在細(xì)胞中得定位可分為兩種形式:即以可溶性或不溶性(包涵體)狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中;或者通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì),甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列得存在就是蛋白質(zhì)分泌得前提條件分泌型異源蛋白得表達(dá)以分泌形式表達(dá)目得蛋白得優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式得優(yōu)點(diǎn):目得蛋白穩(wěn)定性高重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中,其穩(wěn)穩(wěn)定性大約就是在細(xì)胞質(zhì)中得10倍目得蛋白易于分離目得蛋白末端完整相當(dāng)多得真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí),蛋白質(zhì)N端得甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸

桿菌得信號(hào)肽編碼序列重組在一起,一旦分泌型表達(dá),其N(xiāo)端得甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽得剪切過(guò)程中被有效除去分泌型異源蛋白得表達(dá)以分泌形式表達(dá)目得蛋白得優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式得缺點(diǎn):相對(duì)其它生物細(xì)胞而言,大腸桿菌得蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá),少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá),但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多,因此目前用于產(chǎn)業(yè)化得異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有,但并不普遍分泌型異源蛋白得表達(dá)蛋白質(zhì)得分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白得隨機(jī)折疊,分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中得重組蛋白很少形成分子間得二硫鍵交聯(lián),因此與包涵體相比,分泌型重組蛋白具有較高比例得正確構(gòu)象,生物活性得回收率增加,且對(duì)蛋白酶不敏感

分泌型異源蛋白得表達(dá)分泌型目得蛋白表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建包括大腸桿菌在內(nèi)得絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外,但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌得抗菌蛋白(細(xì)菌素)分泌到培養(yǎng)基中,這一過(guò)程嚴(yán)格依賴(lài)于細(xì)菌素釋放蛋白,它激活定位于內(nèi)上得磷酸酯酶,導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜得通透性增大。因此,只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適得質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型得受體細(xì)胞。此時(shí),用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列與目得基因得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞,并使用相同性質(zhì)得啟動(dòng)子介導(dǎo)目得基因得轉(zhuǎn)錄,則可實(shí)現(xiàn)目得蛋白從重組大腸桿菌中得完全分泌。融合型異源蛋白得表達(dá)除了直接表達(dá)異源蛋白外,還可將外源基因與受體菌自身得蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起,并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出得蛋白質(zhì)稱(chēng)為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中,通常受體細(xì)菌得蛋白部分位于N端,異源蛋白位于C端。通過(guò)在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入得蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn),可以在體外從純化得融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白融合型異源蛋白得表達(dá)以融合形式表達(dá)目得蛋白得優(yōu)缺點(diǎn)目得蛋白穩(wěn)定性高尤其對(duì)分子量較小得多肽效果更佳目得蛋白易于分離利用受體蛋白成熟得抗體、配體、底物進(jìn)目得蛋白表達(dá)率高與受體蛋白共用一套完善得表達(dá)元件

胞內(nèi)形成良好得空間構(gòu)象,且大多具有水溶性目得蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中,產(chǎn)品主要得成本往往就在該工段行親與層析,可以快速獲得純度較高得融合蛋白目得蛋白溶解性好由于受體蛋白得存在,融合蛋白往往能在目得蛋白需要回收融合蛋白需要裂解與進(jìn)一步分離,才能獲融合型異源蛋白得表達(dá)融合型目得蛋白表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒得構(gòu)建原則:受體細(xì)胞得結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá),且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親與層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處得序列設(shè)計(jì)十分重要,它直接決定著為目得蛋白分離回收創(chuàng)造條件外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因得下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整得受體結(jié)構(gòu)基因,目得就是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份得分子量過(guò)于接近,融合蛋白得裂解工藝兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致得翻譯閱讀框架融合型異源蛋白得表達(dá)融合型目得蛋白表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建用于融合蛋白構(gòu)建得受體蛋白:谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白(TrxA)維持良好空間構(gòu)象pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A(SAPA)免疫親與層析pRIT2T外膜蛋白(OmpF)促進(jìn)分泌b-半乳糖苷酶(LacZ)免疫親與層析泛素蛋白(Ubi)維持良好空間構(gòu)象融合型異源蛋白得表達(dá)目得蛋白得回收融合蛋白中受體蛋白部分得存在可能會(huì)影響目得蛋白得空間構(gòu)象與生物活性,如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng),因此在制備與生產(chǎn)藥用目得蛋白時(shí),將融合蛋白中得受體蛋白部分完整除去就是必不可少得工序。融合蛋白得位點(diǎn)專(zhuān)一性斷裂方法有兩種:化學(xué)斷裂法酶促裂解法融合型異源蛋白得表達(dá)目得蛋白得回收用于蛋白位點(diǎn)專(zhuān)一性化學(xué)斷裂得最佳試劑為溴化氰(CNBr)它與多肽鏈中得甲硫氨酸殘基側(cè)鏈得硫醚基反應(yīng),生成溴化亞氨內(nèi)酯,后者不穩(wěn)定,在水得作用下肽鍵斷裂,形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段得甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基,而下游肽段N端得第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法得優(yōu)點(diǎn)就是回收率高(可達(dá)到85%以上),專(zhuān)一性強(qiáng),而且所產(chǎn)生得目得蛋白得N端不含甲硫氨酸,與真核生物細(xì)胞中得成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而,如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基,則不能用此方法化學(xué)斷裂法:融合型異源蛋白得表達(dá)目得蛋白得回收酶促裂解法:單殘基位點(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-CLys-C蛋白酶酶促裂解法得特點(diǎn)就是斷裂效率更高,同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)得斷裂位點(diǎn)決定簇,因此可供選擇得專(zhuān)一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專(zhuān)一性最強(qiáng)得商品化蛋白酶分別在多肽鏈中得精氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵,形成不含上述殘基得下游斷裂肽段,與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白得前提條件就是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴(lài)氨酸殘基,如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽,這一限制條件并不苛刻,但大分子量得異源蛋白來(lái)說(shuō),上述三種氨基酸殘基得出現(xiàn)頻率就是相當(dāng)高得ArgCNNC受體蛋白目得蛋白融合型異源蛋白得表達(dá)目得蛋白得回收酶促裂解法:多殘基位點(diǎn)為了克服僅切單一氨基酸殘基得蛋白酶所帶來(lái)得應(yīng)用局限性,可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子得外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列(Ile-Glu-Gly-Arg)得人工接頭片段,該寡肽為具有蛋白酶活性得凝血因子X(jué)a得識(shí)別與作用序列,其斷裂位點(diǎn)在Arg得C末端。純化后得融合蛋白用Xa處理,即可獲得不含上述寡肽序列得目得蛋白。由于Xa得識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成,大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列得概率極少,因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小得目得蛋白產(chǎn)物融合型異源蛋白得表達(dá)目得蛋白得回收酶促裂解法:多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子受體基因接頭目得基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親與層析酶解回收融合型異源蛋白得表達(dá)目得蛋白得回收酶促裂解法:多殘基位點(diǎn)PinpointXatac生物素結(jié)合肽編碼序列Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArgGluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點(diǎn)寡聚型異源蛋白得表達(dá)從理論上講,外源基因得表達(dá)水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄基因得拷貝數(shù)(即基因劑量)呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外,還攜帶其它得可轉(zhuǎn)錄基因,如作為篩選標(biāo)記得抗生素抗性基因等。隨著重組質(zhì)粒拷貝數(shù)得不斷增加,受體細(xì)胞內(nèi)得大部分能量與原料被用于合成所有得重組質(zhì)粒編碼蛋白,而細(xì)胞得正常生長(zhǎng)代謝卻因能量不濟(jì)受到影響,因此通過(guò)增加質(zhì)粒拷貝數(shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物得產(chǎn)量往往不能獲得滿(mǎn)意得效果。另一種通過(guò)增加外源基因劑量而提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量得有效方法就是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體,即將多拷貝得外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上,以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)得策略寡聚型異源蛋白得表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目得蛋白得優(yōu)缺點(diǎn)目得蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)得前提下,增加目得基因得拷貝數(shù),可以穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽在一定程度上改善表達(dá)量目得產(chǎn)物回收困難短肽由于缺乏有效得空間結(jié)構(gòu),在細(xì)菌細(xì)胞中得半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似得長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu),因而抗蛋白酶降解得能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解與進(jìn)一步分離,才能獲最終分子,但裂解后得短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性寡聚型異源蛋白得表達(dá)寡聚型目得蛋白表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略:寡聚型異源蛋白得表達(dá)寡聚型目得蛋白表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建構(gòu)建舉例:PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBglIIBamHIEcoRIBamHIBglIIGATCTAGCCTAGEcoRIBamHIBglIIEcoRIBamHIBglIIEcoRI+BamHIBglII+BamHIBamHI整合型異源蛋白得表達(dá)以整合形式表達(dá)目得蛋白得優(yōu)缺點(diǎn)目得基因穩(wěn)定表達(dá)整合型得目得基因隨受體細(xì)胞染色體DNA得復(fù)制而復(fù)制,在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定,工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下可以連續(xù)目得基因表達(dá)率低單拷貝整合得目得基因表達(dá)率受到限制,此時(shí)可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償培養(yǎng)而不丟失目得基因表達(dá)盒,這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目得得基因工程案例特別有意義整合型異源蛋白得表達(dá)DNA體內(nèi)重組得基本原理在生物體細(xì)胞尤其就是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),廣泛存在著DNA得遺傳重組機(jī)制,其可能得生物學(xué)功效就是促進(jìn)生物種群得進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)得遺傳重組可分為兩大類(lèi):轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型同源序列依賴(lài)型整合型異源蛋白得表達(dá)DNA體內(nèi)重組得基本原理轉(zhuǎn)位因子就是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在得一類(lèi)無(wú)復(fù)制能力得DNA可移動(dòng)因子,不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同得轉(zhuǎn)位因子,例如:轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型得體內(nèi)重組:轉(zhuǎn)位因子家族噬菌體 G片段(G-Fragment)原核細(xì)菌 插入順序(IS)真核細(xì)菌 轉(zhuǎn)座子(Tn、Ty)高等植物可移動(dòng)因子(Ac、Ds)高等動(dòng)物 跳躍基因(mobilgene)整合型異源蛋白得表達(dá)DNA體內(nèi)重組得基本原理轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型得體內(nèi)重組:轉(zhuǎn)位因子得結(jié)構(gòu)IS(1kb)Ty(5kb)Tn(2-20kb)ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識(shí)別位點(diǎn)阻遏基因IRIRIRIRISIS整合型異源蛋白得表達(dá)DNA體內(nèi)重組得基本原理轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型得體內(nèi)重組:整合形式整合型異源蛋白得表達(dá)DNA體內(nèi)重組得基本原理在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中,染色體DNA鏈上得兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂得同源重組,其頻率與細(xì)菌種類(lèi)、兩個(gè)同源區(qū)之間得距離同源區(qū)得長(zhǎng)度、同源程度密切相關(guān)。一般地說(shuō),距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高,重組得頻率也就越高,反之亦然。同源重組有整合與交換兩種形式,前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn),而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn)同源序列依賴(lài)型得體內(nèi)重組:基本形式整合型異源蛋白得表達(dá)DNA體內(nèi)重組得基本原理同源序列依賴(lài)型得體內(nèi)重組:同源整合ori目得基因同源區(qū)域標(biāo)記基因整合位點(diǎn)染色體DNA整合型異源蛋白得表達(dá)DNA體內(nèi)重組得基本原理同源序列依賴(lài)型得體內(nèi)重組:同源交換ori目得基因同源區(qū)域標(biāo)記基因交換區(qū)域染色體DNAori標(biāo)記基因+蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建無(wú)論就是在真核生物還就是在原核細(xì)胞中,重組目得蛋白表達(dá)后都會(huì)面臨被降解得命運(yùn),其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短得受體細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)。在大多數(shù)情況下,重組目得蛋白得不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)得敏感性。然而越來(lái)越多得實(shí)驗(yàn)表明,重組目得蛋白在受體細(xì)胞內(nèi)得半衰期可以通過(guò)蛋白序列得人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞得改造加以調(diào)整與控制。蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大多數(shù)不穩(wěn)定得重組目得蛋白就是被大腸桿菌中得蛋白酶La與Ti降解得,兩者分別由lon與clp基因編碼,其蛋白水解活性依賴(lài)于ATP。lon基因由熱休克等環(huán)境壓力激活,細(xì)胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白得過(guò)量表達(dá)也可作為一種環(huán)境壓力誘導(dǎo)lon基因得表達(dá)。lon-得大腸桿菌突變株可使原來(lái)半衰期較短得細(xì)菌調(diào)控蛋白(如SulA、RscA、lN)穩(wěn)定性大增,因此被廣泛用作外源基因高效表達(dá)得受體菌。蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞得改造lon基因缺陷得大腸桿菌受體(lon-):蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建大腸桿菌中龐大得熱休克蛋白家族對(duì)異常或異源蛋白得降解也有重要作用,其機(jī)理就是脅迫異常或異源蛋白形成一種對(duì)蛋白酶識(shí)別與降解較有利得空間構(gòu)象,從而提高異常或異源蛋白對(duì)蛋白酶得敏感性。熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR得突變株均呈現(xiàn)出對(duì)異源蛋白降解作用得嚴(yán)重缺陷,特別就是lon-htpR-得雙缺陷株,非常適合高效表達(dá)各種不穩(wěn)定得重組異源蛋白。蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞得改造htpR基因缺陷得大腸桿菌受體(htpR-):蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建大量得實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在所有得極性氨基酸中,天門(mén)冬氨酸(Asp)得存在對(duì)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性得效應(yīng)最顯著,而且Asp殘基離C末端越近,蛋白質(zhì)得穩(wěn)定性就越大。更為重要得就是,在多種結(jié)構(gòu)與功能相互獨(dú)立得蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基,都能顯著地延長(zhǎng)這些蛋白質(zhì)得半衰期,因此具有普遍意義。抗蛋白酶得重組異源蛋白序列得設(shè)計(jì)多肽鏈C末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性得影響:蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)得構(gòu)建大量得實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明,如果多肽鏈得N末端序列中含有較高比例得Ala、Asn、Cys、Gln、His,則蛋白質(zhì)得穩(wěn)定性顯著改善。相反,N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr得真核生物蛋白質(zhì),在真核與原核細(xì)胞中得半衰期通常很短,尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列(PEST序列),就是胞內(nèi)蛋白酶得超敏感區(qū)。抗蛋白酶得重組異源蛋白序列得設(shè)計(jì)多肽鏈N末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性得影響:4基因工程菌得遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性得表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性得策略基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性得表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性得表現(xiàn)形式

基因工程菌得遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒得不穩(wěn)定性,這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式:結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾,導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能得喪失分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸(curing)基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性得表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性得產(chǎn)生機(jī)制受體細(xì)胞中得限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子得降解能量、物質(zhì)得匱乏與外源基因表達(dá)產(chǎn)物得毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞外源基因得高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常得生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng):關(guān)閉合成途徑,啟動(dòng)降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)得不均勻分配這就是重組質(zhì)粒逃逸得基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性得轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子得缺失重排基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性得表現(xiàn)與機(jī)制重組質(zhì)粒得逃逸率一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒,這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱(chēng)為當(dāng)含有重組質(zhì)粒得工程菌在非選擇性條件下生長(zhǎng)時(shí),培養(yǎng)系統(tǒng)中稱(chēng)為重組質(zhì)粒得宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸得原因有:高溫培養(yǎng)、表面活性劑(SDS)、藥物(利福平)、染料(吖啶)促使重組質(zhì)粒滲漏受體細(xì)胞中得核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配,細(xì)胞所含重組質(zhì)粒拷貝數(shù)得差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)得增多而加劇改善基因工程菌不穩(wěn)定性得策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增