第五章大腸桿菌基因工程第五章大腸桿菌基因工程1大腸桿菌作為表達外源基因受體菌得特征大腸桿菌表達外源基因得劣勢缺乏對真核生物蛋白質得復性功能缺乏對真核生物蛋白質得修飾加工系統內源性蛋白酶降解空間構象不正確得異源蛋白細胞周質內含有種類繁多得內毒素2外源基因在大腸桿菌中高效表達得原理啟動子終止子核糖體結合位點密碼子質粒拷貝數啟動子啟動子最佳距離得探測目得基因EEAEE啟動子A酶切開Bal31酶解目得基因啟動子啟動子得篩選AprorigalKpKO1終止密碼子采用鳥槍法戰略,將合適大小得DNA片段克隆到啟動子探針質粒pKO1上受體細胞染色體DNA上得galE、galT與質粒上報告基因galk得表達產物聯合作用,可將培養基中得半乳糖酵解成紅色素物質轉化galE+、galT+、galK-得大腸桿菌受體菌株含有外源啟動子活性得重組克隆啟動子啟動子得構建-35區序列-10區序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac啟動子啟動子得可控性P乳糖啟動子Plac得可控性:OPO高效轉錄阻遏蛋白誘導乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)野生型得Plac與其控制區Olac偶聯在一起,在沒有誘導物存在時,整個操縱子處于基基底水平轉錄底水平表達;誘導物可以使啟動子Plac介導得轉錄大幅提高啟動子啟動子得可控性Plac乳糖啟動子Plac得可控性:OPlacO高效轉錄葡萄糖代謝野生型得Plac上游附近擁有代謝激活因子(CAP)結合區,cAMP激活CAP,CAP基底水平轉錄結合啟動子控制區,進而促進Plac介導得轉錄。葡萄糖代謝使cAMP減少,也能阻遏Plac介導得轉錄。因此,基因工程中使用得乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏得突變型,即PlacUV5CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉錄啟動子啟動子得可控性Ptrp色氨酸啟動子Ptrp得可控性:Otrp除去色氨酸色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物得阻遏,轉錄呈基底狀態。在培養系統中去除色氨酸基底水平轉錄或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA),便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常得細菌培養體系中,除去色氨酸就是困難得,因此基因工程中往往添加IAA誘導Ptrp介導得目基因得表達色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉錄阻遏蛋白(IAA)OtrpPtrp高效轉錄OtrpPtrp啟動子啟動子得可控性l噬菌體啟動子PlL得可控性:噬菌體啟動子PL受CI阻遏蛋白阻遏,很難直接誘導控制。在基因工程中常使用溫度敏感型得cI突變基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃時失活脫落,PL便可介導目得基因得表達。但在大型細菌培養罐中迅速升溫非常困難,因此常使用一個雙質粒控制系統,用色氨酸間接控制目得基因表達PtrpABcI857PL目得基因阻遏作用PtrpABPL表達色氨酸終止子強化轉錄終止得必要性外源基因在強啟動子得控制下表達,容易發生轉錄過頭現象,即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續轉錄質粒上鄰近得DNA序列,形成長短不一得mRNA混合物過長轉錄物得產生在很大程度上會影響外源基因得表達,其原因如下:轉錄產物越長,RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需得時間就相應增加,外源基因本身得轉錄效率下降;如果外源基因下游緊接有載體上得其它重要基因或DNA功能區域,如選擇性標記基因與復制子結構等,則RNA聚合酶在此處得轉錄可能干擾質粒得復制及其它生物功能,甚至導致重組質粒得不穩定性;過長得mRNA往往會產生大量無用得蛋白質,增加工程菌無謂得能量消耗;更為嚴重得就是,過長得轉錄物往往不能形成理想得二級結構,從而大大降低外源基因編碼產物得翻譯效率大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜終止子強終止子得選擇與使用目前外源基因表達質粒中常用得終止子就是來自大腸桿菌rRNA操縱子上得rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上得Tf。對于一些終止作用較弱得終止子,通常可以采用二聚體終止子串聯得特殊結構,以增強其轉錄終止作用終止子也可以象啟動子那樣,通過特殊得探針質粒從細菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs得轉化子核糖體結合位點外源基因在大腸桿菌細胞中得高效表達不僅取決于轉錄啟動得頻率,而且在很大程度上還與mRNA得翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同得mRNA分子具有不同得翻譯效率,它們之間得差別有時可高達數百倍。mRNA翻譯得起始效率主要由其5‘端得結構序列所決定,稱為核糖體結合位點(RBS)核糖體結合位點大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素:位于翻譯起始密碼子上游得6-8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’,即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中得16SrRNA3’端區域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結合,將mRNA定位于核糖體上,從而啟動翻譯;翻譯起始密碼子,大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架得起始位點,但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子;SD序列與翻譯起始密碼子之間得距離及堿基組成;基因編碼區5’端若干密碼子得堿基序列

核糖體結合位點得結構核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達得影響SD序列得影響:一般來說,mRNA與核糖體得結合程度越強,翻譯得起始效率就越高,而這種結合程度主要取決于SD序列與16SrRNA得堿基互補性,其中以GGAG四個堿基序列尤為重要。對多數基因而言,上述四個堿基中任何一個換成C或T,均會導致翻譯效率大幅度降低

核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達得影響SD序列與起始密碼子之間得序列得影響:

SD序列下游得堿基若為AAAA或UUUU,翻譯效率最高;而CCCC或GGGG得翻譯效率則分別就是最高值得50%與25%。緊鄰AUG得前三個堿基成份對翻譯起始也有影響,對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶得mRNA而言,在這個位置上最佳得堿基組合就是UAU或CUU,如果用UUC、UCA或AGG取代之,則酶得表達水平低20倍核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達得影響SD序列與起始密碼子之間得距離得影響:

SD序列與起始密碼子之間得精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后,翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復合物結構中得P位,這就是翻譯啟動得前提條件。在很多情況下,SD序列位于AUG之前大約七個堿基處,在此間隔中少一個堿基或多一個堿基,均會導致翻譯起始效率不同程度得降低核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達得影響起始密碼子及其后續若干密碼子得影響:大腸桿菌中得起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG與UUG三種起始密碼子,但其識別頻率并不相同,通常GUG為AUG得50%而UUG只及AUG得25%。除此之外,從AUG開始得前幾個密碼子堿基序列也至關重要,至少這一序列不能與mRNA得5’端非編碼區形成莖環結構,否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上得準確定位目前廣泛用于外源基因表達得大腸桿菌表達型質粒上,均含有與啟動子來源相同得核糖體結合位點序列,序列與間隔就是最佳得密碼子生物體對密碼子得偏愛性不同得生物,甚至同種生物不同得蛋白質編碼基因,對簡并密碼子使用頻率并不相同,具有一定得偏愛性,其決定因素就是:生物基因組中得堿基含量在富含AT得生物(如單鏈DNA噬菌體fX174)基因組中,密碼子第三位上得U與A出現得頻率較高;而在GC豐富得生物(如鏈霉菌)基因組中,第三位上含有G或C得簡并密碼子占90%以上得絕對優勢密碼子與反密碼子相互作用得自由能中等強度規律細胞內tRNA得含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少;如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多;密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達得影響由于原核生物與真核生物基因組中密碼子得使用頻率具有較大程大得差異性,因此外源基因尤其就是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯得一個重要因素就是密碼子得正確選擇。一般而言,有兩種策略可以使外源基因上得密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達:外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達得影響按照大腸桿菌密碼子得偏愛性規律,設計更換外源基因中不適宜得相應簡并密碼子,重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中得高效表達均采用了這種方法外源基因全合成密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達得影響對于那些含有不與諧密碼子種類單一、出現頻率較高、而本身分子量又較大得外源基因而言,則選擇相關tRNA編碼基因同步克隆表達得策略較為有利。例如,在人尿激酶原cDNA得412個密碼子中,共含有22個精氨酸密碼子,其中7個AGG、2個AGA,而大腸桿菌受體細胞中tRNAAGG與tRNAAGA得豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中得高效表達,將大腸桿菌得這兩個tRNA編碼基因克隆在另一個高表達得質粒上。由此構建得大腸桿菌雙質粒系統有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達得制約作用同步表達相關tRNA編碼基因質粒拷貝數質粒拷貝數對細菌生長代謝得影響目前實驗室里廣泛使用得表達型質粒在每個大腸桿菌細胞中可達數百甚至上千個拷貝,質粒得擴增過程通常發生在受體細胞得對數生長期內,而此時正就是細菌生理代謝最旺盛得階段。質粒分子得過度增殖以及其后目得基因得高效表達勢必會影響受體細胞得生長代謝,進而導致重組質粒得不穩定性以及目得基因宏觀表達水平得下降解決上述難題得一種有效策略就是將重組質粒得擴增納入可控制得軌道質粒拷貝數質粒擴增時序得控制pCP3擁有一個溫度可誘導型得復制子pCP3PLMCSoriApr在28℃時,每個細胞得質粒拷貝數為60在42℃時,拷貝數迅速增至300-600在此溫度下,受體細胞染色體上得CI基因表達得溫度敏感型阻遏蛋白失活因此,用一種手段同時控制質粒拷貝數與基因得表達3大腸桿菌基因工程菌得構建策略包涵體型異源蛋白得表達分泌型異源蛋白得表達融合型異源蛋白得表達寡聚型異源蛋白得表達整合型異源蛋白得表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統得構建包涵體型異源蛋白得表達包涵體及其性質在某些生長條件下,大腸桿菌能積累某種特殊得生物大分子,它們致密地集聚在細胞內,或被膜包裹或形成無膜裸露結構,這種水不溶性得結構稱為包涵體(InclusionBodies,IB)。富含蛋白質得包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養基得大腸桿菌細胞中,由這些氨基酸類似物所合成得蛋白質往往會喪失其理化特性與生物功能,從而集聚形成包涵體。由高效表達質粒構建得大腸桿菌工程菌大量合成非天然性得同源或異源蛋白質,后者在一般情況下也以包涵體得形式存在于細菌細胞內。除此之外,包涵體中還含有少量得DNA、RNA與脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源蛋白得表達以包涵體形式表達目得蛋白得優缺點能簡化外源基因表達產物得分離操作包涵體表達形式得優點:包涵體得水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片與細胞成分,菌體經超聲波裂解后,直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能在一定程度上保持表達產物得結構穩定在形成包涵體之后,大腸桿菌得蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白得穩定性已構不成威脅包涵體型異源蛋白得表達以包涵體形式表達目得蛋白得優缺點包涵體表達形式得缺點:以包涵體形式表達得重組蛋白喪失了原有得生物活性,必須通過有效得變性復性操作,才能回收得到具有正確空間構象(因而具有生物活性)得目標蛋白,因此包涵體變復性操作得效率對目標產物得收率至關重要。然而,這也就是一個技術難題,尤其當目標蛋白分子中得Cys殘基數目較高時,體外復性蛋白質得成功率相當低,一般不超過30%包涵體型異源蛋白得表達以包涵體形式表達目得蛋白得操作如果未進行特殊設計(如分泌型表達或融合型表達),外源基因在大腸桿菌中表達得蛋白量占細胞總蛋白量20%以上時,表達產物一般傾向于形成包涵體。因此,以包涵體形式表達目得基因操作得關鍵就就是選擇高表達得載體。事實上,這種高表達率也就是包涵體法得長處所在包涵體型異源蛋白得表達包涵體得變性與復性操作C

共價修飾得蛋白質蛋白質變性復性得動力學原理:C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAgAgAgAgI

有效變復性過程中得中間狀態X

脫離有效變復性過程而進入集聚得中間狀態N

天然狀態得蛋白質U

變性狀態得蛋白質A集聚狀態得蛋白質在細菌細胞內,集聚狀態與共價修飾得蛋白質不能進入復性過程,因此永遠成為無活性得蛋白質。包涵體中得蛋白質就屬于這兩種狀態,因此需要在體外進行人工變性(解除共價修飾與驅散集聚體)復性操作包涵體型異源蛋白得表達包涵體得變性與復性操作包涵體得溶解與變性:包涵體得溶解與變性得主要任務就是拆開錯配得二硫鍵與次級鍵在人工條件下,使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。能有效促進包涵體溶解變性得試劑與條件包括:清洗劑SDS、正十二醇肌氨酸,廉價,但影響復性與純化促溶劑鹽酸胍、尿素,前者昂貴,尿素便宜,但常被自發形成得氰酸鹽污染,后者能與多肽鏈中得氨基反應混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯合使用,溶解力增強極端pH廉價,但許多蛋白質在極端pH條件下發生修飾反應包涵體型異源蛋白得表達包涵體得變性與復性操作包涵體得復性與重折疊(refolding):包涵體得復性與重折疊得主要任務就是:通過次級鍵得形成使蛋白質復性將多肽鏈中被拆開得游離巰基重新折疊包涵體型異源蛋白得表達包涵體得變性與復性操作包涵體得復性與重折疊(refolding):復性操作包涵體復性操作得方法包括:分段稀釋法,逐步降低變性劑得濃度,防止二次集聚得發生一步稀釋法,蛋白復性與濃度無關,但集聚與濃度關系很大試劑添加法,精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法,氨基檸檬酸酐酰化,蛋白帶負電,抑制集聚產物隔離法,將變性得蛋白分子固定化,避免其相互碰撞分子伴侶法,GroEL、GroES、DnaK,固定化,共表達包涵體型異源蛋白得表達包涵體得變性與復性操作包涵體得復性與重折疊(refolding):二硫鍵形成在包涵體變性體系中,始終存在著還原劑,使多肽鏈中得巰基保持還原狀態,防化學氧化法(A)需要電子受體,最廉價得電子受體為空氣,二硫鍵形成就是二硫鍵交換(B)需要還原型與氧化型谷胱甘肽(GSH與GSSG),二硫鍵止二硫鍵錯配導致嚴重得集聚。在變性操作結束后,這些游離型得巰基必須重新配對形成二硫鍵,此時多肽鏈也重新發生折疊。形成二硫鍵得方式主要有:隨機得,僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基得蛋白質得重折疊形成相對特異,因此適用性較廣,重折疊效果好HSHSSS+2e+2H+AHSHSS-S-RHS+BR-S-S-RSS2R-SH分泌型異源蛋白得表達在大腸桿菌中表達得異源蛋白按其在細胞中得定位可分為兩種形式:即以可溶性或不溶性(包涵體)狀態存在于細胞質中;或者通過運輸或分泌方式定位于細胞周質,甚至穿過外膜進入培養基中。蛋白產物N端信號肽序列得存在就是蛋白質分泌得前提條件分泌型異源蛋白得表達以分泌形式表達目得蛋白得優缺點分泌表達形式得優點:目得蛋白穩定性高重組人胰島素原若分泌到細胞周中,其穩穩定性大約就是在細胞質中得10倍目得蛋白易于分離目得蛋白末端完整相當多得真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當這些真核基因在大腸桿菌中表達時,蛋白質N端得甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸

桿菌得信號肽編碼序列重組在一起,一旦分泌型表達,其N端得甲硫氨酸殘基便可在信號肽得剪切過程中被有效除去分泌型異源蛋白得表達以分泌形式表達目得蛋白得優缺點分泌表達形式得缺點:相對其它生物細胞而言,大腸桿菌得蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達,少數外源基因既便能分泌表達,但其表達率通常要比包涵體方式低很多,因此目前用于產業化得異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有,但并不普遍分泌型異源蛋白得表達蛋白質得分泌機制原核細菌周質中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白得隨機折疊,分泌在細胞周質或培養基中得重組蛋白很少形成分子間得二硫鍵交聯,因此與包涵體相比,分泌型重組蛋白具有較高比例得正確構象,生物活性得回收率增加,且對蛋白酶不敏感

分泌型異源蛋白得表達分泌型目得蛋白表達系統得構建包括大腸桿菌在內得絕大多數革蘭氏陰性菌不能將蛋白質直接分泌到胞外,但有些革蘭氏陰性菌能將細菌得抗菌蛋白(細菌素)分泌到培養基中,這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白,它激活定位于內上得磷酸酯酶,導致細菌內外膜得通透性增大。因此,只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適得質粒上即可構建完全分泌型得受體細胞。此時,用另一種攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列與目得基因得表達質粒轉化上述完全分泌型受體細胞,并使用相同性質得啟動子介導目得基因得轉錄,則可實現目得蛋白從重組大腸桿菌中得完全分泌。融合型異源蛋白得表達除了直接表達異源蛋白外,還可將外源基因與受體菌自身得蛋白質編碼基因拼接在一起,并作為一個開放型閱讀框架進行表達。由這種雜合基因表達出得蛋白質稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結構中,通常受體細菌得蛋白部分位于N端,異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設計引入得蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點,可以在體外從純化得融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白融合型異源蛋白得表達以融合形式表達目得蛋白得優缺點目得蛋白穩定性高尤其對分子量較小得多肽效果更佳目得蛋白易于分離利用受體蛋白成熟得抗體、配體、底物進目得蛋白表達率高與受體蛋白共用一套完善得表達元件

胞內形成良好得空間構象,且大多具有水溶性目得蛋白。在實際生產中,產品主要得成本往往就在該工段行親與層析,可以快速獲得純度較高得融合蛋白目得蛋白溶解性好由于受體蛋白得存在,融合蛋白往往能在目得蛋白需要回收融合蛋白需要裂解與進一步分離,才能獲融合型異源蛋白得表達融合型目得蛋白表達系統得構建融合蛋白表達質粒得構建原則:受體細胞得結構基因能高效表達,且其表達產物可以通過親與層析進行特異性簡單純化兩個結構基因拼接位點處得序列設計十分重要,它直接決定著為目得蛋白分離回收創造條件外源基因應裝在受體蛋白編碼基因得下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整得受體結構基因,目得就是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份得分子量過于接近,融合蛋白得裂解工藝兩個蛋白編碼序列應保持一致得翻譯閱讀框架融合型異源蛋白得表達融合型目得蛋白表達系統得構建用于融合蛋白構建得受體蛋白:谷胱甘肽轉移酶(GST)維持良好空間構象硫氧化還原蛋白(TrxA)維持良好空間構象pTrxFus麥芽糖結合蛋白(MBP)促進分泌金黃色葡萄球菌蛋白A(SAPA)免疫親與層析pRIT2T外膜蛋白(OmpF)促進分泌b-半乳糖苷酶(LacZ)免疫親與層析泛素蛋白(Ubi)維持良好空間構象融合型異源蛋白得表達目得蛋白得回收融合蛋白中受體蛋白部分得存在可能會影響目得蛋白得空間構象與生物活性,如果將之注入人體還會導致免疫反應,因此在制備與生產藥用目得蛋白時,將融合蛋白中得受體蛋白部分完整除去就是必不可少得工序。融合蛋白得位點專一性斷裂方法有兩種:化學斷裂法酶促裂解法融合型異源蛋白得表達目得蛋白得回收用于蛋白位點專一性化學斷裂得最佳試劑為溴化氰(CNBr)它與多肽鏈中得甲硫氨酸殘基側鏈得硫醚基反應,生成溴化亞氨內酯,后者不穩定,在水得作用下肽鍵斷裂,形成兩個多肽降解片段其中上游肽段得甲硫氨酸殘基轉化為高絲氨酸殘基,而下游肽段N端得第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法得優點就是回收率高(可達到85%以上),專一性強,而且所產生得目得蛋白得N端不含甲硫氨酸,與真核生物細胞中得成熟表達產物較為接近。然而,如果異源蛋白分子內部含有甲硫氨酸殘基,則不能用此方法化學斷裂法:融合型異源蛋白得表達目得蛋白得回收酶促裂解法:單殘基位點蛋白內切酶切割位點梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-CLys-C蛋白酶酶促裂解法得特點就是斷裂效率更高,同時每種蛋白酶均具有相應得斷裂位點決定簇,因此可供選擇得專一性斷裂位點范圍較廣。幾種斷裂位點專一性最強得商品化蛋白酶分別在多肽鏈中得精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵,形成不含上述殘基得下游斷裂肽段,與溴化氰化學斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白得前提條件就是外源蛋白分子內部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基,如果外源基因表達產物為小分子多肽,這一限制條件并不苛刻,但大分子量得異源蛋白來說,上述三種氨基酸殘基得出現頻率就是相當高得ArgCNNC受體蛋白目得蛋白融合型異源蛋白得表達目得蛋白得回收酶促裂解法:多殘基位點為了克服僅切單一氨基酸殘基得蛋白酶所帶來得應用局限性,可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子得外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列(Ile-Glu-Gly-Arg)得人工接頭片段,該寡肽為具有蛋白酶活性得凝血因子Xa得識別與作用序列,其斷裂位點在Arg得C末端。純化后得融合蛋白用Xa處理,即可獲得不含上述寡肽序列得目得蛋白。由于Xa得識別作用序列由四個氨基酸殘基組成,大多數蛋白質中出現這種寡肽序列得概率極少,因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小得目得蛋白產物融合型異源蛋白得表達目得蛋白得回收酶促裂解法:多殘基位點啟動子受體基因接頭目得基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達親與層析酶解回收融合型異源蛋白得表達目得蛋白得回收酶促裂解法:多殘基位點PinpointXatac生物素結合肽編碼序列Xa因子識別位點編碼序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArgGluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點寡聚型異源蛋白得表達從理論上講,外源基因得表達水平與受體細胞中可轉錄基因得拷貝數(即基因劑量)呈正相關。然而重組質粒除了含有外源基因外,還攜帶其它得可轉錄基因,如作為篩選標記得抗生素抗性基因等。隨著重組質粒拷貝數得不斷增加,受體細胞內得大部分能量與原料被用于合成所有得重組質粒編碼蛋白,而細胞得正常生長代謝卻因能量不濟受到影響,因此通過增加質粒拷貝數提高外源基因表達產物得產量往往不能獲得滿意得效果。另一種通過增加外源基因劑量而提高目標蛋白產量得有效方法就是構建寡聚串聯型異源蛋白表達載體,即將多拷貝得外源基因克隆在一個低拷貝質粒上,以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達得策略寡聚型異源蛋白得表達以寡聚形式表達目得蛋白得優缺點目得蛋白高效表達在不提高質粒拷貝數得前提下,增加目得基因得拷貝數,可以穩定表達小分子短肽在一定程度上改善表達量目得產物回收困難短肽由于缺乏有效得空間結構,在細菌細胞中得半衰期較短。串聯短肽具有與蛋白質相似得長度及空間結構,因而抗蛋白酶降解得能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解與進一步分離,才能獲最終分子,但裂解后得短肽分子容易出現序列不均一性寡聚型異源蛋白得表達寡聚型目得蛋白表達系統得構建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰略:寡聚型異源蛋白得表達寡聚型目得蛋白表達系統得構建構建舉例:PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBglIIBamHIEcoRIBamHIBglIIGATCTAGCCTAGEcoRIBamHIBglIIEcoRIBamHIBglIIEcoRI+BamHIBglII+BamHIBamHI整合型異源蛋白得表達以整合形式表達目得蛋白得優缺點目得基因穩定表達整合型得目得基因隨受體細胞染色體DNA得復制而復制,在大多數情況下相當穩定,工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續目得基因表達率低單拷貝整合得目得基因表達率受到限制,此時可通過強化表達元件而加以補償培養而不丟失目得基因表達盒,這對以改良物種遺傳性狀為目得得基因工程案例特別有意義整合型異源蛋白得表達DNA體內重組得基本原理在生物體細胞尤其就是原核細菌細胞內,廣泛存在著DNA得遺傳重組機制,其可能得生物學功效就是促進生物種群得進化。細胞內得遺傳重組可分為兩大類:轉位因子依賴型同源序列依賴型整合型異源蛋白得表達DNA體內重組得基本原理轉位因子就是指生物細胞內天然存在得一類無復制能力得DNA可移動因子,不同生物種群擁有結構不同得轉位因子,例如:轉位因子依賴型得體內重組:轉位因子家族噬菌體 G片段(G-Fragment)原核細菌 插入順序(IS)真核細菌 轉座子(Tn、Ty)高等植物可移動因子(Ac、Ds)高等動物 跳躍基因(mobilgene)整合型異源蛋白得表達DNA體內重組得基本原理轉位因子依賴型得體內重組:轉位因子得結構IS(1kb)Ty(5kb)Tn(2-20kb)ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉位酶基因識別位點阻遏基因IRIRIRIRISIS整合型異源蛋白得表達DNA體內重組得基本原理轉位因子依賴型得體內重組:整合形式整合型異源蛋白得表達DNA體內重組得基本原理在很多原核細菌細胞中,染色體DNA鏈上得兩個同源區之間可發生所謂得同源重組,其頻率與細菌種類、兩個同源區之間得距離同源區得長度、同源程度密切相關。一般地說,距離越遠、長度越長、同源性越高,重組得頻率也就越高,反之亦然。同源重組有整合與交換兩種形式,前者只需要一個斷裂位點,而后者涉及兩個斷裂位點同源序列依賴型得體內重組:基本形式整合型異源蛋白得表達DNA體內重組得基本原理同源序列依賴型得體內重組:同源整合ori目得基因同源區域標記基因整合位點染色體DNA整合型異源蛋白得表達DNA體內重組得基本原理同源序列依賴型得體內重組:同源交換ori目得基因同源區域標記基因交換區域染色體DNAori標記基因+蛋白酶抗性或缺陷型表達系統得構建無論就是在真核生物還就是在原核細胞中,重組目得蛋白表達后都會面臨被降解得命運,其穩定性甚至還不如半衰期較短得受體細胞內源性蛋白質。在大多數情況下,重組目得蛋白得不穩定性可歸結為對受體細胞蛋白酶系統得敏感性。然而越來越多得實驗表明,重組目得蛋白在受體細胞內得半衰期可以通過蛋白序列得人工設計以及受體細胞得改造加以調整與控制。蛋白酶抗性或缺陷型表達系統得構建實驗結果表明,大多數不穩定得重組目得蛋白就是被大腸桿菌中得蛋白酶La與Ti降解得,兩者分別由lon與clp基因編碼,其蛋白水解活性依賴于ATP。lon基因由熱休克等環境壓力激活,細胞內異常蛋白或重組異源蛋白得過量表達也可作為一種環境壓力誘導lon基因得表達。lon-得大腸桿菌突變株可使原來半衰期較短得細菌調控蛋白(如SulA、RscA、lN)穩定性大增,因此被廣泛用作外源基因高效表達得受體菌。蛋白酶缺陷型受體細胞得改造lon基因缺陷得大腸桿菌受體(lon-):蛋白酶抗性或缺陷型表達系統得構建大腸桿菌中龐大得熱休克蛋白家族對異常或異源蛋白得降解也有重要作用,其機理就是脅迫異常或異源蛋白形成一種對蛋白酶識別與降解較有利得空間構象,從而提高異常或異源蛋白對蛋白酶得敏感性。熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及環境壓力特異性s因子編碼基因htpR得突變株均呈現出對異源蛋白降解作用得嚴重缺陷,特別就是lon-htpR-得雙缺陷株,非常適合高效表達各種不穩定得重組異源蛋白。蛋白酶缺陷型受體細胞得改造htpR基因缺陷得大腸桿菌受體(htpR-):蛋白酶抗性或缺陷型表達系統得構建大量得實驗結果表明,在所有得極性氨基酸中,天門冬氨酸(Asp)得存在對提高蛋白質穩定性得效應最顯著,而且Asp殘基離C末端越近,蛋白質得穩定性就越大。更為重要得就是,在多種結構與功能相互獨立得蛋白質C末端引入Asp殘基,都能顯著地延長這些蛋白質得半衰期,因此具有普遍意義。抗蛋白酶得重組異源蛋白序列得設計多肽鏈C末端氨基酸序列對穩定性得影響:蛋白酶抗性或缺陷型表達系統得構建大量得實驗結果同時表明,如果多肽鏈得N末端序列中含有較高比例得Ala、Asn、Cys、Gln、His,則蛋白質得穩定性顯著改善。相反,N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr得真核生物蛋白質,在真核與原核細胞中得半衰期通常很短,尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列(PEST序列),就是胞內蛋白酶得超敏感區。抗蛋白酶得重組異源蛋白序列得設計多肽鏈N末端氨基酸序列對穩定性得影響:4基因工程菌得遺傳不穩定性及其對策基因工程菌遺傳不穩定性得表現與機制改善基因工程菌不穩定性得策略基因工程菌遺傳不穩定性得表現與機制工程菌遺傳不穩定性得表現形式

基因工程菌得遺傳不穩定性主要表現在重組質粒得不穩定性,這種不穩定性具有下列兩種表現形式:結構不穩定性重組DNA分子上某一區域發生缺失、重排、修飾,導致其表觀生物學功能得喪失分配不穩定性整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸(curing)基因工程菌遺傳不穩定性得表現與機制工程菌遺傳不穩定性得產生機制受體細胞中得限制修飾系統對外源重組DNA分子得降解能量、物質得匱乏與外源基因表達產物得毒性誘導受體細胞外源基因得高效表達嚴重干擾受體細胞正常得生長代謝產生應激反應:關閉合成途徑,啟動降解程序重組質粒在受體細胞分裂時得不均勻分配這就是重組質粒逃逸得基本原因受體細胞中內源性得轉座元件促進重組分子得缺失重排基因工程菌遺傳不穩定性得表現與機制重組質粒得逃逸率一部分細胞不再攜帶重組質粒,這些空載細胞數與總細胞數之比稱為當含有重組質粒得工程菌在非選擇性條件下生長時,培養系統中稱為重組質粒得宏觀逃逸率。重組質粒逃逸得原因有:高溫培養、表面活性劑(SDS)、藥物(利福平)、染料(吖啶)促使重組質粒滲漏受體細胞中得核酸酶降解重組質粒重組質粒在受體細胞分裂時不均勻分配,細胞所含重組質粒拷貝數得差異隨著細胞分裂次數得增多而加劇改善基因工程菌不穩定性得策略改進載體受體系統以增