三、活力測定種子活力(seedvigor)是種子質量的重要指標之一,也是反映種用價值的主要組成部分,與種子田間出苗質量密切相關。活力的測定經過幾十年的研究，已經取得了重大進展。在美國和歐洲，活力測定應用已經很普遍，許多種子公司把活力測定作為常規的檢測項目。12004年出版的《國際種子檢驗規程》將活力定義為：“種子活力是指在廣泛的環境條件下，決定可接受發芽率的種子批的活性和性能那些特性的綜合表現”。并作了進一步的闡述，種子活力不是一種簡單的測定概念，而是一種能表達如下有關種子批性能多種特性的綜合概念：（1）種子發芽和幼苗生長速率和整齊度；（2）種子在不利環境條件下的出苗能力；（3）貯藏后，特別是能保持發芽力的性能。高活力種子批即使在不適宜的環境條件下，仍具有良好性能的潛力。2種子活力簡單地說就是指高發芽率種子批間在田間表現的差異。由此可見，種子活力是比發芽率更敏感的指標，在高發芽率的種子批中，仍然表現出活力的差異。通常高發芽率的種子具有較高活力，但兩者不存在正相關。3（一）種子活力測定的必要性1.活力測定是保證田間出苗率的必要手段2.活力測定是種子工作各個環節質量評價與技術改進的重要手段3.活力測定是研究種子衰老（劣變）的必要方法4.活力測定是育種者對育種材料進行有效選擇的重要措施4（二）種子活力測定方法分類和要求1.活力測定方法的分類種子活力測定方法的種類多達數十種。其分類的方法歸納起來不外乎直接法和間接法兩類。直接法是在檢驗室條件下模擬田間不良條件測定田間出苗率的方法，如低溫處理是模擬早春播種期的低溫條件；磚砂（礫）試驗是模擬田間板結土壤或粘土地區的條件。間接法是在檢驗室內測定與田間出苗率（活力）相關的種子特性的方法，如測定某些生理生化指標（酶的活性、呼吸強度等）及測定生化劣變處理后的發芽率（加速老化試驗、人工劣變試驗等）。5現將ISTA和AOSA推薦和建議的活力測定方法及種類簡介如下：ISTA活力測定方法（《活力測定力法手冊》，1995版）6第一類是推薦種子活力測定方法，也是目前《國際種子檢驗規程》已經列入的方法，包括兩種方法：電導率測定（conductivitytest）、加速老化測定（acceleratedageingtest）。這兩種推薦方法已基本上標準化，將在下面作詳細的介紹。7第二類是建議的種子活力測定方法，包括七種不同類型的方法：①冷凍測定（coldtest）；②低溫發芽測定（coolgerminationtest）；③人工控制劣變試驗（controlleddeteriorationtest）；④復合逆境活力測定（complexstressingvigortest）；⑤希爾特納試驗（hiltnertest）；⑥幼苗生長測定（seedlinggrowthtest）包括幼苗測量和幼苗評定，幼苗測量包括幼苗生長測定和幼苗生長速率測定，幼苗評定包括卷紙法和砂法；⑦四唑測定（tetrazoliumtest）包括剖面四唑法和糊粉層四唑測定兩種方法。8AOSA活力測定方法（《活力測定手冊》）AOSA于1983年頒發了《活力測定手冊》，該手冊也包括兩類的方法。第一類是廣泛應用的方法：①幼苗生長和評定試驗（幼苗活力分級、幼苗生長速率測定發芽末期幼苗長度和干重）；②逆境試驗（包括加速老化試驗、低溫試驗、冷發芽試驗）；③生化試驗（包括四唑法和電導率法）。第二類是推薦應用的方法：①幼苗生長和評定試驗；②逆境試驗（包括磚砂試驗、滲透逆境試驗即高滲試驗）；③生化測定（包括呼吸測定、谷氨酸脫羧酶（GADA）活性測定、ATP含量測定）。AOSA所列方法較多，其中有六種測定方法與ISTA規定的方法基本相同。9（三）選用活力測定方法的原則和要求1．選用原則根據當地土壤氣候條件選用適宜的方法，如低溫試驗適合早春播種季節低溫氣候條件，不適合于早春溫暖地區，再如磚砂試驗適用于粘土地區或雨后土壤板結情況，不適用于土壤較為疏松地區，歐洲土壤粘重應用磚砂試驗較多，而美國則很少應用，僅作為推薦方法。根據作物的特性選用適宜的方法。如低溫試驗和冷發芽法適用發芽期間耐寒性較差的喜溫作物，如玉米、大豆等，不適用于耐寒性較強的作物，如大麥、小麥、油菜等。又如電導率測定是豌豆種子的典型測定方法，其測定結果與田間出苗率高度相關，但對其他作物種子并非適合，其測定結果與田間出苗相關性較差。102．選用要求①節約費用，儀器設備不能太昂貴；②簡單易行，測定技術不太復雜，易于推廣；③快速省時，短期內可獲得測定結果；④結果準確，能真實反映一批種子的活力水平，且與田間出苗率有良好相關；⑤重演性好，在同一檢驗室不同檢驗人員或在不同檢驗室能獲得比較一致的結果。11（四）活力測定方法的基本要求1．試樣種子試驗樣品來源必須是凈種子。凈種子可以從凈度分析后的凈種子中隨機數取，也可以從送驗樣品中按凈種子的標準直接隨機數取。除委托檢驗外，所需種子數和重復必須隨機從種子批的有代表性樣品的凈種子部分中數取。２．方法和試驗條件活力測定方法各不相同，具體的方法和使用儀器及試驗條件將在本章以后各節中加以說明。12３．對照樣品活力測定需要比標準發芽試驗更加嚴格的試驗條件控制，因此，種子活力測定的檢驗室需要制備對照樣品。設置對照樣品的目的是為活力測定結果提供一致性的內在質量控制。對照樣品的結果差異反映了試驗條件（如溫度、種子水分或其他因素）的微小變異，而會導致明顯影響結果的可靠性。134．結果計算與表示將在本章以后各節具體方法中加以敘述，給出其詳細程序。5．結果報告填報采用本章第三節和第四節規定的程序，將活力測定結果，填報在檢驗報告“其他測定”欄內。同時結果還須附有檢測方法的說明，包括必要時測定方法及條件包括時間、溫度和種子水分等信息。14（五）種子活力測定主要方法介紹

1.加速老化試驗（1）原理加速老化試驗(acceleratedageingtest，以下簡稱AA測定)是根據高溫(40～45℃)和高濕(100％相對濕度)能導致種子快速劣變這一原理進行測定。高活力種子能忍受逆境條件處理，劣變較慢；而低活力種子劣變較快，長成較多的不正常幼苗或者完全死亡。AA測定最早是由Delouehe等(1973)創造的用來預測許多種的種子壽命。經過多年的發展，目前AA測定主要用于兩方面，一是預測田間出苗率二是預測耐藏性15（2）適用范圍與局限性《國際種子檢驗規程》所規范的AA測定法適用于大豆種子；ISTA手冊指出該法也適用于許多其他種，詳見表15-2所列的種。AA測定結果也是可以控制的。AOSA和ISTA用大豆種子核準試驗表明在試驗室間有很大的一致性，并證實AA發芽試驗與田間出苗的關系。現在也有足夠證據證實用該試驗能取得重演性結果。因此，AOSA現在認為作為大豆試驗的方法已經標準化，可以推薦。但是必須按本節所規定的程序和儀器進行操作，在溫度控制、樣品大小或老化時間的小量改動會引起最后水分和(或)發芽率的變化。16（3）儀器和藥品（１）老化外箱：推薦應用水套培養箱，保持恒溫(41土0.3)℃。如果沒有水套培養箱，其他有加水的加熱培養箱也可。使用這些培養箱，水應在外箱內，以防凝結。水掉在內箱盒上，會在蓋內產生凝結，提高種子水分，降低發芽率，增加發霉。因此，當外箱有大量凝結水時，當心保護內箱在老化期間的小水點積累。外箱通常不需要很準確的溫度控制，需要附加控制，保持溫度均勻。（２）老化內箱：老化內箱為帶蓋的塑料盒，大小為11.0cm×11.0cm×3.5cm，內有一個網架盤10.0cm×l0.0cm×0．3cm(網孔為14×18)。老化內箱可以購買，也可以自制（見圖15-3）。注意蓋不應密封（見圖15-3）。1718（３）天平：感量為0.001g。（４）水：去離子水或蒸餾水。（５）帶刻度的容量杯：刻度從0至100mL，從標準的容量器或有50mL刻度的容器準確量取40mL水。（６）鋁盒(供種子水分測定)。（７）發芽試驗設備。19（4）程序預備試驗：①檢查老化外箱老化外箱的溫度必須經過國家標準計量院的檢定或類似的溫度計。②檢查溫度收集按規定的程序／系統進行操作的老化外箱的溫度和其均勻度的記錄數據，如果記錄顯示能達到表15-2所規定的溫度（對于大豆種子，所有水平應達到4l±0.3℃)下才能進行AA測定。③保證老化內箱的清潔度為了防止菌類污染，使用過的老化內箱、蓋和網架需經過熱消毒或用15％次氯酸鈉溶液洗凈并烘干，才可進行AA測定。20測定每一種子批的程序①檢查種子水分如果不知道測定種子批的水分，應采用烘箱法測定種子批的水分。對于水分低于10％或高于14％的種子批，應在AA測定前將其水分調節至10％～14％。記錄種子水分，決定是否必須提高種子水分或降低種子水分至規定范圍。21②準備老化內箱把40mL去離子水或蒸餾水放入老化內箱，然后放入網架，確信水不滲到網架和后加的種子上。從凈種子中稱取42g(至少含有200粒種子)種子，稱重后放在網架上，攤成一層。老化的種子最好不要經過處理，然而，該作物種子是以殺菌劑處理銷售的，可以使用處理種子。每次外箱用于AA測定，應包括一個對照樣品。保證每一內箱有蓋(不要封口)。注意蓋不應密封。22③使用老化外箱內箱排成一排放在架上，同時放入外箱內。為了使溫度均勻一致，外箱內的兩個內箱之間間隔大約為2.5cm。記錄內箱放人外箱的時間。準確監控老化外箱的溫度在表15-2的范圍和時間內，如大豆種子在(41±0.3)℃溫度保持72h。在老化規定期間，不能打開外箱的門。如果這時已經打開門，應從箱中取出種子重新進行測定。23

不同作物種子AA測定老化條件24④發芽試驗經72h老化時間后，從外箱取出內箱，記錄這時的時間。取出一小時內用50粒四個重復進行標準發芽試驗。在同一天內如果有許多批種子進行老化試驗，樣品應進行分類，在兩個老化外箱的試驗應間隔1h，以便有時間在老化后進行置床發芽。大豆種子發芽的條件已在GB／T3543.4中給出。25⑤檢查老化后對照樣品的水分在老化結束時進行標準發芽前，從內箱中取出對照樣品的一個小樣品(10～20粒)，馬上稱重，用烘箱法測定種子水分(以鮮重為基礎)。記錄對照樣品種子水分，如果種子水分低于或高于表15-2所規定的值(對于大豆，種子水分應在27％～30％)，則試驗結果不準確，應重作試驗。26⑥結果計算與表示用四次50粒重復的平均結果表示人工老化發芽結果，以百分率表示。⑦結果說明解釋AA測定并不提供一個絕對的活力范圍，只是通過一段時間的高溫高濕逆境后進行發芽試驗的結果。該結果與老化前同一種子批的發芽試驗結果比較，如果AA結果類同于標準發芽試驗結果為高活力，低于標準發芽試驗結果為中至低活力。這樣，可用該結果來排列種子批活力，來判定貯藏潛力或每一種子批的播種潛力。272.電導率測定高活力種子細胞膜完整性好，浸入水中后滲出的可溶性物質或電解質少，浸泡液的電導率低。電導率與田間出苗率成顯著的負相關，借此可用電導率的高低判別種子活力的高低。大粒豆類種子的電導率結果提供比標準發芽與田間出苗率更強的相關性。28（1）原理細胞膜在種子生理成熟前的種子發育中發生了結構變化，種子劣變發生于成熟前和發芽前的吸脹。劣變生化變化和生理紊亂所引起的細胞膜完整性變化是造成種子活力的最主要差異。在早期吸脹時，細胞膜的恢復和修補可能影響種子的滲漏率。種子重組恢復細胞膜的速度越快，滲漏液越少。高活力種子能迅速修復細胞膜能力，而低活力種子較差，所以，高活力種子所測得的電導率比低活力種子低。低活力種子批的滲漏會造成二次感染，種子滲漏的營養液加速土壤微生物活動和二次感染。種子中滲出的碳水化合物的數量也與細菌生長呈正相關。29（2）適用范圍與局限性《國際種子檢驗規程》所規范的電導率測定適用于豌豆種子；ISTA活力手冊指出該法也適用于許多其他種，如大粒豆科種子（特別是大豆、綠豆等）、棉花、玉米、番茄、洋蔥等種子。AOSA和ISTA活力測定委員會認為，菜豆和大豆的電導率測定結果具有重演性，與田間出苗率有較大的相關性，該測定已被種子產業用來評定菜豆種子出售前的出苗率。已在歐洲、澳大利亞、新西蘭和北美已得到廣泛地使用。電導率測定作為一個快速、客觀的活力測定方法，特別易用于大多數種子檢驗室檢測，因為該項目的儀器投入較少、人員培訓簡單。30有幾種因素影響電導率結果，第一種因素是大粒豆類種皮的物理損傷導致水分快速吸收，造成機械損傷和高水平的電解質滲漏，因此，某些研究者建議除去物理損傷種子。然而機械損傷種子的肉眼觀察是主觀的、不準確的，這些種子結果的例外會導致種子活力的過高估計。只能按照ISTA規定從樣品中扦取凈種子，這樣才能提供不偏樣品供檢驗。第二種因素是種子大小，這涉及到在測定前通過稱重而消失，并將結果表示為μScm-1g-1。第三種因素是原始種子水分，在測定前測定種子水分，調節種子水分不在10%～14%的種子批，可以消除這個問題。第四種是處理種子的影響，用大豆種子的研究表明，并不支持從處理后的種子去除殺菌劑，但是其他種子處理對電導率的影響并不知道，如果可能，應測定未處理的種子。31（3）儀器和藥品①電導儀可用直流電或交流電直接讀數的電導儀，電極常數必須達到1.0（電極常數是指電極板之間的有效距離與極板的面積之比）。有關具體品牌、型號的電導儀可向ISTA秘書處咨詢。②水最好使用去離子水，也可使用蒸餾水。凡使用的水必須進行電導率測定。在20℃下，去離子水電導率不超過2μScm－1；蒸餾水電導率不超過5μScm－1。使用前水應保持在（20±1）℃。32③燒杯或容器為了保證有適宜的水浸沒種子和電極，燒杯和容器的容量為500mL，基部寬80mm±5mm。容器使用前必須沖洗干凈，并用去離子水或蒸餾水沖洗兩次。④發芽箱、培養箱或發芽室滿足保持（20±1）℃的恒溫。⑤烘箱滿足溫度達到130℃或者103℃。⑥天平感量達到0.01g。⑦鋁盒（供種子水分測定用）。33（4）程序預備試驗①校正電極②核查對照種子批的電導率③檢查儀器清潔度④檢查溫度34測定每一種子批的程序①檢查種子水分如果不知道測定種子批的水分，應采用烘箱法測定種子批的水分。對于水分低于10%或高于14%的種子批，應在浸種前將其水分調至10%～14%。35②準備燒杯準確量取250mL去離子水或蒸餾水，放入500mL的燒杯中。每種子批測定4個燒杯。含水的所有燒杯應用鋁箔或薄膜蓋子蓋好，以防止污染。在盛放種子前，先在20℃下平衡24h。為了控制水的質量，每次測定準備兩個只含去離子水或蒸餾水的對照杯。③準備試樣隨機從種子批凈種子部分數取每個各為50粒的四個次級樣品，稱重至0.01g。36④浸種已稱重的試樣放入已盛有250mL去離子水的500mL、先粘有標鑒的容器中。輕輕搖晃容器，確保所有種子完全浸沒。所有容器用鋁箔或薄膜蓋蓋好，在（20±1)℃放置24h。在同一時間內測定的燒杯的數量不能太多，不能超過電導率評定的數目，通常為10～12個容器，一批測定一般不超過15min。⑤準備電導儀試驗前先啟動電導儀至少15min。每次測定同時用去離子水或蒸餾水填滿容器杯400～600mL沖洗電極，作為沖洗水，去離子水電導率不應超過2μScm－1或蒸餾水不超過5μScm－1。37⑥測定溶液電導率24h（±15min）的浸種結束后，應馬上測定溶液的電導率。盛有種子的燒杯應輕微搖晃10～15s，移去鋁箱或薄膜蓋，電極插入不要過濾的溶液，注意不要把電極放在種子上。測定幾次直到獲得一個穩定值。測定一個試樣重復后，用去離子水或蒸餾水沖洗電極兩次，用濾紙吸干，再測定下一個試樣重復。如果在測定期間觀察到硬實，測定電導率后應將其除去，記數，干燥表面，稱量，并從50粒種子樣品重量中減去其重量。38⑦扣除試驗用水的電導率在（20±1)℃測定對照杯的去離子水或蒸餾水的電導率，比較該數與日常的水源記錄（如果讀數高于日常水源讀數，表明電極清潔度有問題，應重新清洗電極，重新測定另一對照杯）。每一重復應從上述容器的測定值中減去對照杯中的測定值（燒杯的背景值）。處理種子的送驗樣品可能已經殺菌劑處理。目前沒有證據表明種子殺菌劑處理會影響電導率結果，但是沒有對所有的商用種子處理評定過。但是，不同純度的商用殺菌劑中的某些含有添加劑會嚴重改變電導結果。所以，對于經過殺菌劑處理的種子應特別小心，特別是使用新的殺菌劑。39⑧結果計算與表示根據下列公式計算每一重復的種子重量的每克電導率：4次重復間平均值為種子批的結果。四次重復間容許差距為5μScm－1g－1（最低和最高的差），如超過，應重做4次重復。40⑨結果說明解釋根據電導率測定結果，即用活力水平對種子批進行排列。英國已在豌豆上應用多年，總結出表15-3的經驗。41表15-3豌豆種子電導率值的解釋423.種子活力的其他測定方法（1）幼苗生長特性測定幼苗生長特性測定主要包括幼苗生長測定、幼苗評定測定、種子發芽速率、發芽指數和活力指數測定等方法。這類測定方法是根據高活力種子幼苗生長快、幼苗健壯、生長正常、幼苗株大和重量較重等生長特性，而低活力種子則相反，借此來評定種子活力水平的差異。43①幼苗生長測定幼苗生長測定方法適用于具有直立胚芽和胚根的禾谷類和蔬菜類作物種子。其測定方法是取試樣4份，各25粒。各取發芽紙3張(30cm×45cm)，取其中1張畫線，先在紙長軸中心畫一條橫線作為中心線，距頂端15cm，并在其上、下每隔1cm畫平行線。在中心線上平均間隔畫25個點，在每點上放一粒種子，胚根端朝向紙卷底部，再蓋兩層濕潤發芽紙，紙的基部向上折疊2cm，將紙松卷成4cm直徑的筒狀，用橡皮筋扎好，將紙卷豎放在容器內，上用塑料袋覆蓋，置于黑暗恒溫箱內培養7d，溫度為正常發芽所規定的溫度，然后統計苗長；計算每對平行線之間的胚芽尖端的數目；按下列公式求出幼苗平均長度。式中：L為胚芽平均長度(cm)；

n為每對平行線之間的胚芽尖端數；

x為每對平行線之間中點至中心線之間的距離(cm)；

N為種子試樣粒數。發芽試驗中不正常幼苗不統計長度。4445直根作物種子可用直立玻板發芽法測定其幼根長度：各取濾紙2張，其中1張劃一條中線，用水濕潤貼在玻板上。將25粒種子等距排列在中心線上，將另一張濾紙濕潤后蓋上，將玻板以70°角直立置于水盤內，放在25℃黑暗下培養3d后測量根的長度，計算平均值。據報道萵苣田間出苗率與萵苣種子發芽3d的根長密切相關。46②幼苗評定試驗幼苗評定試驗(seedlingevaluationtest)適用于大粒豆類種子。這些種子不能用幼苗長度表示活力，因其細弱苗可達相當的長度，可采用標準發芽方法，幼苗評定時分成不同等級。例如，豌豆種子試驗方法如下：取試樣4份，各50粒。將1～2mm的粗砂清洗消毒后加水，使保持最大持水力約15％(W/W)，再放入4個容積為15cm×20cm×10cm的聚乙烯盒中，移于生長箱或培養箱中，于20℃、相對濕度95％-98％的條件下，光照12h、以光強度12000Lx培養，經6d后取出幼苗，洗滌干凈，進行幼苗評定，先將種子分成發芽和不發芽兩類，再將幼苗分成3級：A健壯幼苗胚芽強壯、深綠色。初生根強壯或初生根少而有大量次生根。B細弱幼苗胚芽短或細長，初生根少或較弱，但屬正常幼苗。C不正常幼苗根或芽殘缺或根芽破裂，苗色褪綠等。第一級為高活力種子，第二級為低活力而具有發芽力的種子，將第一、二級相加即為種子發芽率。47③發芽速率測定發芽速率測定(germinationratetest)是一種最古老和最簡單的方法，適用于各種作物的活力測定。其方法是采用標準發芽試驗，每日記載正常發芽種子數(牧草、樹木等種子發芽緩慢，可隔日或隔數日記載)，然后按公式計算各種與發芽速度有關的指標。A初期發芽率測定：許多作物種子如小麥、大豆、玉米等，采用計算3d發芽率。也可采用計算發芽勢或初次計算發芽率。B發芽達90％所需天數或達50％所需天數測定：達50％所需天數測定可適用于發芽率較低的種子樣品。48C發芽指數測定：式中：Dt為相應的發芽天數，Gt為與Dt相對應的不同時間（t天）的發芽數。∑為總和。測定結果GI值與活力成正相關關系。D活力指數測定式中：S為一定時期內幼苗長度(cm)或幼苗重量(g)，GI為發芽指數。49E簡易活力指數測定：此法適用于發芽快速的作物種子，如油菜、黃麻等。式中：G為發芽率，S為幼苗長度(cm)或重量(g)。F平均發芽天數（MGT）的測定：式中：G，

Dt與發芽指數公式中相同。50G相對發芽率測定此法適用于發芽緩慢的樹木或牧草種子。先計算峰值(PV)，然后計算平均發芽率(MDG)，最后計算發芽值（GV）51幼苗生長和幼苗評定試驗以及發芽速度的測定，均采用標準發芽試驗，必須嚴格控制發芽溫度、濕度和光照等條件，否則容易產生誤差，同時測定人員必須具有評定幼苗的經驗，才能獲得準確結果。52(2)抗冷測定抗冷測定(coldtest)適用于春播喜溫作物種子，如玉米、棉花、大豆、豌豆等。而秋播作物種子如大麥、小麥、油菜等種子，在發芽時具有忍耐低溫的能力，故不宜應用此法測定活力。抗冷測定通常采用土壤卷法和土壤盒法，是將種子置于低溫和潮濕的土壤中，經一定時間處理后移至適宜溫度處生長，模擬早春田間逆境條件，觀察和評定種子發芽成苗的能力。53①土壤卷法取面積為30cm×60cm的發芽紙3張，各取種子50粒，4次重復。每一重復的種子排放在雙層的、經充分吸濕并在10℃下預冷的紙巾上，種子在距紙巾頂邊6cm和12cm處排成兩行，每行25粒種子，然后覆蓋土壤(從所需測定作物的地里取土)，保證所有種子直接與土壤接觸。再用一張吸濕的發芽紙覆蓋在上面，并將播有種子和土壤的發芽紙松卷成筒狀，豎放在內有金屬線分隔器的塑料桶或其他容器內。保證紙巾卷互相不接觸。在塑料桶或容器頂部套蓋上塑料袋防止水分的散失，將容器置于10℃(±0.5)的低溫黑暗下處理7d，再移至25℃的黑暗條件下生長5d，按照標準發芽試驗的標準評價幼苗，也可以將幼苗按強壯、細弱等進行分類。54②土壤盒法各取玉米種子或大豆種子50粒，重復4次，播于裝有3～4cm深的土壤盒內，然后蓋土2cm，在10℃的低溫下處理7d后，移入適宜溫度下培養。玉米、水稻于30℃條件下經3d；大豆、豌豆于25℃條件下經4d；計算發芽率，凡正常幼苗作為高活力種子計算。此法手續簡單，但所占空間較大。55(3)低溫發芽試驗低溫發芽試驗(coolgerminationtest)主要適用于棉花，也可用于高粱、黃瓜和水稻等種子。棉花早春播種常遇低溫，會引起胚根損傷，下胚軸生長速率降