光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響

光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響研究項(xiàng)目情況名稱：光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響類別：自由申請(qǐng)項(xiàng)目研究類型：應(yīng)用基礎(chǔ)研究申請(qǐng)金額：6萬(wàn)元研究期限：2011年10月-2013年10月光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響申請(qǐng)者及項(xiàng)目組情況申請(qǐng)人：楊陽(yáng)博士副主任醫(yī)師項(xiàng)目組人員統(tǒng)計(jì)總?cè)藬?shù)高級(jí)中級(jí)初級(jí)在讀碩士生

72131參加單位：1光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響一、研究?jī)?nèi)容和意義（摘要）

白念珠菌粘附于陰道上皮細(xì)胞引起炎癥刺激以及陰道上皮局部免疫防御機(jī)制低下是復(fù)發(fā)性陰道念珠菌病（RVVC）發(fā)病的兩大原因，白念珠菌常以生物膜的形式存在，在生物膜微環(huán)境內(nèi)，白念珠菌能有效地抵御機(jī)體免疫力和抗真菌藥物，誘導(dǎo)抗真菌藥物耐藥性的增加，從而導(dǎo)致臨床白念珠菌藥物治療效果不理想；而細(xì)胞壁蛋白基因HWPI和ALS3在白念珠菌生物膜形成和細(xì)胞粘附過(guò)程起重要作用；光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響

光動(dòng)力療法對(duì)微生物有抑制作用，但具體作用機(jī)制仍未明確；本課題通過(guò)構(gòu)建白念珠菌生物膜模型，分析光動(dòng)力療法作用前后白念珠菌的細(xì)胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表達(dá)變化，白念珠菌生物膜生長(zhǎng)動(dòng)力活性的變化，探討光動(dòng)力療法對(duì)防治復(fù)發(fā)性陰道念珠菌病的作用機(jī)制。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響二、立論依據(jù)VVC最常見(jiàn)的真菌感染性疾病，主要由白念珠菌引起，它是生育期婦女最常見(jiàn)的外陰陰道炎癥。RVVC病因較為復(fù)雜，治療有一定的難度，從而對(duì)婦女的身心健康造成很大影響。白念珠菌常以生物膜(biofilm)的形式存在。在生物膜這樣一個(gè)微環(huán)境內(nèi)，白念珠菌能有效地抵御機(jī)體免疫力和抗真菌藥物，誘導(dǎo)抗真菌藥物耐藥性的增加，從而導(dǎo)致臨床治療困難。因此關(guān)于白念珠菌生物膜的有效治療方案的研究刻不容緩。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響1、白念珠菌生物膜是誘導(dǎo)抗真菌藥物耐藥的生物基礎(chǔ)

生物膜是一種獨(dú)特而復(fù)雜、相互依存的與表面有關(guān)的微生物群體。對(duì)各種抗真菌藥物具有高度耐藥性是白念珠菌生物膜與游離態(tài)白念珠菌最大的區(qū)別之一。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響白念珠菌生物膜對(duì)抗真菌藥物耐藥的機(jī)制尚未明了。生物膜相關(guān)微生物耐藥機(jī)制包括:生物膜細(xì)胞低生長(zhǎng)率;ECM生成后產(chǎn)生物理屏障,妨礙藥物滲透入生物膜;生物膜耐藥相關(guān)基因的表達(dá)。但它們?cè)诎啄钪榫锬つ退幹械淖饔萌圆淮_定。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響2細(xì)胞壁蛋白HWPI和ALS3在白念珠菌生物膜形成和細(xì)胞粘附過(guò)程中起重要作用白念珠菌粘附于生物材料等固體表面形成生物被膜，這和游離培養(yǎng)截然不同，是細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)了特殊的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，引起復(fù)雜的生理變化。這期間經(jīng)歷了粘附和聚集、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)基因的選擇性表達(dá)等過(guò)程。其中粘附在整個(gè)過(guò)程中起著重要的作用。主要表現(xiàn)在細(xì)胞壁蛋白AlS3的缺失，會(huì)導(dǎo)致生物膜形成障礙，在導(dǎo)入能自主表達(dá)該基因的載體后，又能恢復(fù)形成生物被膜的能力。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響3光動(dòng)力療法應(yīng)用于抗白念珠菌的前景光動(dòng)力療法：是結(jié)合光敏劑、光、氧三種無(wú)害物質(zhì)造成局部光氧化損傷的治療方法。光動(dòng)力療法廣泛應(yīng)用在腫瘤及皮膚疾病治療領(lǐng)域目前光動(dòng)力治療微生物的研究仍處于初級(jí)階段，部分體外實(shí)驗(yàn)中光動(dòng)力療法已被證實(shí)具有抗微生物的作用。例：巴西Betania等發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力療法在特定條件下可以滅活體外培養(yǎng)的口腔上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附的白念珠菌。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響光動(dòng)力療法應(yīng)用受光敏劑選擇、微生物光敏劑吸收率、光源選擇、照射環(huán)境及時(shí)間等多因素影響，具體的治療效果還需進(jìn)一步研究。鑒于以上問(wèn)題，進(jìn)一步研究光動(dòng)力療法替代藥物能否影響白念珠菌生物膜粘附、成熟、致病過(guò)程，對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)展陰道念珠菌病的防治具有重要意義。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響既然白念珠菌生物膜的粘附、成熟以及作用局部陰道上皮炎癥致病過(guò)程中扮演著重要的角色，而細(xì)胞壁蛋白HWPI和ALS3在白念珠菌生物膜形成和細(xì)胞粘附過(guò)程中起重要作用，光動(dòng)力療法是否能通過(guò)破壞念珠菌生物膜而達(dá)到的治療陰道念珠菌病值得我們進(jìn)一步深入探討。因而，我們的研究假說(shuō)是光動(dòng)力療法通過(guò)減低細(xì)胞壁蛋白HWPI和ALS3降低白念珠菌生物膜粘附性致抑制白念珠菌，從而發(fā)揮治療陰道念珠菌病和防止復(fù)發(fā)的作用。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響4本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。1、本研究針對(duì)陰道念珠菌病首次提出非藥物治療方案——光動(dòng)力療法，從白念珠菌生物膜致病過(guò)程入手，探討光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌生物膜體外模型粘附性作用機(jī)制，為光動(dòng)力療法治療陰道念珠菌病的理論研究找到新的切入點(diǎn)和開(kāi)拓新的思路。2、本研究在國(guó)內(nèi)首次通過(guò)檢測(cè)光動(dòng)力療法中光敏劑對(duì)白色念珠菌生物膜的最低抑菌濃度，及光動(dòng)力療法處理前后白色念珠菌的細(xì)胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表達(dá)變化，從而分析和探索光動(dòng)力療法對(duì)白色念珠菌生物膜的抑制作用。3、本研究的開(kāi)展為進(jìn)一步拓展光動(dòng)力療法治療范圍奠定基礎(chǔ)。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響三、研究方案1、研究目標(biāo)：構(gòu)建白念珠菌生物膜體外模型。通過(guò)檢測(cè)光動(dòng)力療法中光敏劑白念珠菌生物膜的最低抑菌濃度，及光動(dòng)力療法處理前后白念珠菌的細(xì)胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表達(dá)變化，從而分析和探索光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌生物膜的抑制作用。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響2、研究?jī)?nèi)容：１.成功構(gòu)建白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株生物膜體外模型，并利用激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)觀察其三維結(jié)構(gòu)。2.微量稀釋法測(cè)定光動(dòng)力療法中光敏劑白念珠菌生物膜的最低抑菌濃度。3.XTT法減低法分析光動(dòng)力療法治療前后白念珠菌生物膜生長(zhǎng)動(dòng)力活性的變化。4.用定量RT-PCR方法，檢測(cè)光動(dòng)力療法處理前后，白念珠菌的細(xì)胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表達(dá)變化。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響3、擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題1.白念珠菌生物膜體外模型的成功建立。2.設(shè)計(jì)合理的基因相關(guān)引物。3.建立穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的實(shí)驗(yàn)方法。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響4、采取的研究方法：

（1）構(gòu)建白念珠菌生物膜的體外模型。將白念珠菌菌懸液接種于96孔微量培養(yǎng)板中，使白念珠菌完全黏附于平底的96孔板基底表面，形成白念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)。激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)初步鑒定白念珠菌生物膜的形成。（2）測(cè)定光動(dòng)力療法中光敏劑白念珠菌生物膜的最低抑菌濃度。采用微量稀釋法將光敏劑100μl加到96孔板，再加入濃度為1×106cFu／mI白念珠菌懸浮液100μl，用光動(dòng)力療法處理后，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作物各菌株的最低抑菌濃度（MIC）。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響（3）分析光動(dòng)力療法治療前后白念珠菌生物膜生長(zhǎng)動(dòng)力活性的變化。利用XTT減低法，把XTT-甲萘醌與光動(dòng)力療法處理前后的念珠菌生物膜共培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490nm處，生物膜生長(zhǎng)各時(shí)間段的吸光值，觀察光動(dòng)力療法前后其生長(zhǎng)動(dòng)力曲線變化。結(jié)合上述方法的結(jié)果，分析和推測(cè)光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌及其生物膜的抑制作用。（4）檢測(cè)光動(dòng)力療法處理前后，白念珠菌的細(xì)胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表達(dá)變化。采用RT-PCR等分子生物學(xué)方法，從白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株的全基因組分別擴(kuò)增出胞壁蛋白基因HWP1和ALS3，并測(cè)序鑒定正確。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定光動(dòng)力療法處理前后，白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株中兩種基因表達(dá)量的變化。用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響5、技術(shù)路線：構(gòu)建白念珠菌生物膜的體外模型和光動(dòng)力療法實(shí)驗(yàn)：光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響6、可行性分析1、本課題依托于廣州醫(yī)學(xué)院，廣州醫(yī)學(xué)院呼吸疾病實(shí)驗(yàn)室是廣東地方高校中唯一一個(gè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的相關(guān)研究積累，相關(guān)條件具備，本課題組一直致力于白色念珠生物膜構(gòu)建和光動(dòng)力療法對(duì)其抑制及其機(jī)制研究。目前已經(jīng)成功構(gòu)建了白念珠菌生物膜。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響2、申請(qǐng)者長(zhǎng)期從事真菌的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，系統(tǒng)學(xué)習(xí)并掌握分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，曾參與完成國(guó)家自然科學(xué)基金“新生隱球菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)寄生機(jī)制的研究”（編號(hào)：）科研課題，具有扎實(shí)的科研基本功和創(chuàng)新精神。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響3、課題主要成員為廣州醫(yī)學(xué)院武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院青年科研骨干或碩士研究生，長(zhǎng)期從事光動(dòng)力療法的相關(guān)研究，曾參與省、部級(jí)科研課題廣東省科技廳資助項(xiàng)目（編號(hào)：2003C33907）廣東省科技計(jì)劃重大專項(xiàng)（編號(hào)：2006A20101006）和廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2004B31201019）兩項(xiàng)，并完成其中部分工作，撰寫多篇論文。通過(guò)前期研究已熟練掌握白念珠菌生物膜模型等與本課題密切相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)，已掌握了一套完善的實(shí)時(shí)PCR研究實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程。組成人員結(jié)構(gòu)合理，分工明細(xì)，相互配合默契，有能力如期完成本申報(bào)項(xiàng)目的研究工作。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響7、年度研究計(jì)劃及預(yù)期進(jìn)展

2011年10月—2012年6月：（1）分別構(gòu)建白色念珠標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株菌生物膜的體外模型，用激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)初步鑒定白念珠菌生物膜的形成。（2）測(cè)定光動(dòng)力療法中光敏劑白念珠菌生物膜的最低抑菌濃度。（3）測(cè)定光動(dòng)力療法治療前后白念珠菌生物膜生長(zhǎng)動(dòng)力活性的變化。（4）描繪生長(zhǎng)動(dòng)力曲線。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響2012年7月—2013年10月：根據(jù)Genebank中白念珠菌胞壁蛋白基因HWP1和ALS3的保守序列設(shè)計(jì)引物。利用TRizol按照說(shuō)明書提取總RNA，采用Real-timePCR方法擴(kuò)增，并測(cè)序鑒定正確。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定光動(dòng)力療法處理前后，白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株中兩種基因表達(dá)量的變化。用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。資料的統(tǒng)計(jì)、分析、總結(jié)，論文的撰寫。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響預(yù)期結(jié)果：通過(guò)上述研究，預(yù)計(jì)發(fā)表核心論文3-4篇，SCI文章1-2篇。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響四、研究條件與基礎(chǔ)本課題組一直致力于白色念珠生物膜構(gòu)建和光動(dòng)力療法對(duì)其抑制及其機(jī)制研究。自2008年始，在臨床觀察中，發(fā)現(xiàn)多例尖銳濕疣患者合并復(fù)發(fā)性陰道念珠菌病，用光動(dòng)力療法治療后大大降低了復(fù)發(fā)性念珠菌病的復(fù)發(fā)。之后，開(kāi)始關(guān)注和追蹤國(guó)際有關(guān)光動(dòng)力療法抑制白念珠菌生物膜的進(jìn)展，并收集相關(guān)臨床病例。目前已經(jīng)成功構(gòu)建了白念珠菌生物膜，但光動(dòng)力療法抑制白念珠菌生物膜的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響申請(qǐng)人楊陽(yáng)，男，1971年出生。廣州醫(yī)學(xué)院附屬武警醫(yī)院皮膚科主任，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。現(xiàn)任武警部隊(duì)皮膚性病學(xué)會(huì)副主任委員，廣東省皮膚性病學(xué)會(huì)委員，廣東省醫(yī)師學(xué)會(huì)皮膚分會(huì)委員，廣東省醫(yī)學(xué)激光學(xué)會(huì)委員。2005年畢業(yè)于上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚性病學(xué)專業(yè)，并獲得博士學(xué)位。就讀博士期間，楊陽(yáng)曾參與國(guó)家自然科學(xué)基金“新生隱球菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)寄生機(jī)制的研究”（編號(hào)：），并完成其中部分工作，撰寫多篇論文。主要負(fù)責(zé)本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、組織實(shí)施、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和統(tǒng)計(jì)等工作。光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響申請(qǐng)人楊陽(yáng)近期發(fā)表的論文:[1].楊陽(yáng),廖萬(wàn)清,郭秀軍.新生隱球菌對(duì)鼠小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)組的影響.臨床皮膚科雜志.2007,36（4）：208-211.[2].楊陽(yáng),廖萬(wàn)清,徐紅.無(wú)莢膜隱球菌CAP64對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響.解放軍學(xué)雜志.2005,30（6）：486-487.光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響項(xiàng)目組主要成員及發(fā)表文章：1、劉旖旎，女，1980年出生。2004年就讀廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病專業(yè)，并獲得碩士學(xué)位。現(xiàn)在是廣州醫(yī)學(xué)院附屬武警醫(yī)院皮膚科主治醫(yī)生，現(xiàn)任廣東省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)美容專業(yè)委員會(huì)青年委員。主要負(fù)責(zé)本項(xiàng)目的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析工作。近期發(fā)表論文：[1].查旭山,劉旖旎,李勇.中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性的影響.中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志.2008,22(11):652-654.2、黃清華，女，1980年出生。2006年就讀廣州暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)專業(yè)，并獲得碩士學(xué)位。現(xiàn)在為廣州醫(yī)學(xué)院附屬武警醫(yī)院皮膚科醫(yī)生。主要負(fù)責(zé)本項(xiàng)目分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。近期發(fā)表論文：[1].李君武，黃清華，王珊.玉米特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下結(jié)核hsp65基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定.玉米科學(xué).2009,5：28-31.光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影響已具備的實(shí)驗(yàn)條件,尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑本課題依托于廣州醫(yī)學(xué)院，廣州醫(yī)學(xué)院呼吸疾病實(shí)驗(yàn)室是廣東地方高校中唯一一個(gè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“神經(jīng)遺傳與離子通道病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”是教育部與廣東省共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。另外擁有省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2個(gè)、廳市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室12個(gè)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的相關(guān)研究積累，相關(guān)條件具備，已經(jīng)有本研究所需的大型儀器：（略）光動(dòng)力療法對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因表達(dá)的影