病原生物與免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

病原生物與免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)是本課程重要組成部分，是理論與實(shí)驗(yàn)研究的技術(shù)基礎(chǔ)。通過實(shí)驗(yàn)，加深學(xué)生對(duì)基本理論知識(shí)的理解；通過實(shí)驗(yàn)操作，掌握有關(guān)的基本操作技能和無菌技術(shù)，建立無菌觀念；通過正確地觀察和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)學(xué)生實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度、嚴(yán)肅認(rèn)真的工作作風(fēng)及分析和解決問題的能力。

二、實(shí)驗(yàn)要求

1.在每次實(shí)驗(yàn)前必須復(fù)習(xí)相關(guān)理論知識(shí)，預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，對(duì)實(shí)驗(yàn)的目的、要求、方法和步驟做到心中有數(shù)。 2．實(shí)驗(yàn)過程中，加強(qiáng)無菌觀念，嚴(yán)格無菌操作，操作時(shí)必須戴口罩，不要開風(fēng)扇。 3．實(shí)驗(yàn)過程中，堅(jiān)持實(shí)事求是，認(rèn)真分析，真實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論不符，應(yīng)查找原因。 4．對(duì)實(shí)驗(yàn)過程與結(jié)果應(yīng)認(rèn)真觀察并記錄之，及時(shí)寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

三、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

本門課程的實(shí)驗(yàn)操作對(duì)象多為病原生物，具有一定的傳染性。因此，必須嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則，按要求進(jìn)行操作，防止發(fā)生實(shí)驗(yàn)室感染。1.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿白大衣，離開實(shí)驗(yàn)室前脫下并反折放好，要經(jīng)常清洗，保持潔凈。2.非實(shí)驗(yàn)必要的物品如書包等，不得帶入實(shí)驗(yàn)室。帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的教材和文具，要遠(yuǎn)離操作部位，以免污染。 3．禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飲食、吸煙或用嘴濕潤(rùn)標(biāo)簽、鉛筆等。 4．實(shí)驗(yàn)時(shí)不得高聲談笑和來回走動(dòng)，以保證實(shí)驗(yàn)室的安靜、有序，利于集中精力完成實(shí)驗(yàn)操作。 5.實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)行培養(yǎng)的微生物，應(yīng)做好標(biāo)記及處理方法。

6．要愛護(hù)室內(nèi)儀器設(shè)備，按使用規(guī)則操作，并應(yīng)節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)材料，凡屬操作不當(dāng)損壞者，需報(bào)告老師，進(jìn)行登記。 ７．凡具有傳染性的培養(yǎng)物、帶菌材料、動(dòng)物等，均需按要求處理，不得隨便亂放或用水沖洗。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何物品未經(jīng)許可，不得攜帶出室外。 ８．各種實(shí)驗(yàn)物品應(yīng)按指定地點(diǎn)存放，用過的玻璃器材必須放入消毒缸內(nèi)，禁止隨意放于桌面及沖入水槽。實(shí)驗(yàn)中如發(fā)生差錯(cuò)或意外事故時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，及時(shí)處理，切勿隱瞞，以免發(fā)生傳染。 ９．實(shí)驗(yàn)結(jié)束，應(yīng)清潔實(shí)驗(yàn)儀器，擦凈桌面，歸類放好物品，并用消毒液泡手，再以清水沖洗干凈。值日生負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生清潔，關(guān)好水電、門窗，方可離開實(shí)驗(yàn)室。 10．認(rèn)真觀察并做好實(shí)驗(yàn)記錄，對(duì)需連續(xù)培養(yǎng)觀察的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)每次記錄好觀察現(xiàn)象和結(jié)果，以便分析并應(yīng)實(shí)事求是地寫好每次實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)報(bào)告要簡(jiǎn)潔、準(zhǔn)確、清楚。

實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)檢查【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?１.學(xué)會(huì)：顯微鏡油鏡的使用和保護(hù)方法 ２.掌握：顯微鏡采光的方法要點(diǎn) ３.能夠辨認(rèn)：細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu) ４.學(xué)會(huì)：制備細(xì)菌涂片及革蘭染色方法和結(jié)果判斷

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法】一、顯微鏡油鏡的使用和保護(hù)方法(操作)

（一）油鏡原理

（二）油鏡使用方法

（三）顯微鏡的保護(hù)

（一）油鏡原理細(xì)菌個(gè)體微小，必須借助顯微鏡油鏡放大1000倍才能看到。因玻璃和香柏油折光率相近似(約為1.52)，所以在玻片上加一滴香柏油，把玻片與油鏡頭連接，使由聚光器照射上來的光線通過玻片和香柏油時(shí)，不發(fā)生折射而直接進(jìn)入透鏡的光量增多，視野亮度增強(qiáng)，因而獲得清晰的物象(實(shí)驗(yàn)圖1-1)。

實(shí)驗(yàn)圖1-1油鏡的原理

（二）油鏡使用方法

1．放置顯微鏡2．對(duì)光①聚光器上升到與載物臺(tái)持平。②以自然光為光源時(shí)，宜用平面鏡對(duì)準(zhǔn)光源；采用人工燈光為光源時(shí)，用凹面鏡對(duì)準(zhǔn)光源。③光圈完全打開。

3．轉(zhuǎn)換油鏡頭油鏡頭的三個(gè)標(biāo)志：①油鏡頭上標(biāo)有100×；②鏡頭前端有白色圓圈；③刻有“油”或“Oil”字樣。

4．調(diào)節(jié)焦距 5．觀察方法6．擦鏡 7．顯微鏡還原

（三）顯微鏡的保護(hù)

1．顯微鏡是貴重精密儀器，使用時(shí)要精心愛護(hù)，不得隨意拆御和碰撞。 ２.取送顯微鏡時(shí)應(yīng)輕拿輕放，一手握鏡臂，一手托鏡座，防止因震動(dòng)使鏡頭受損。 ３．顯微鏡的調(diào)節(jié)器只能做有限的旋轉(zhuǎn)，當(dāng)旋轉(zhuǎn)感到有阻力時(shí)應(yīng)立即向反方向旋轉(zhuǎn)退回，以免碰撞損壞鏡頭。細(xì)調(diào)節(jié)器用于焦距的細(xì)微調(diào)節(jié)，使用時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)不宜超過360o，如需要較大幅度調(diào)節(jié)時(shí)，應(yīng)使用粗調(diào)節(jié)器。４.使用顯微鏡要輕拿輕放，平時(shí)放置要注意通風(fēng)干燥，防塵防霉防曬。

二、細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察(示教)

（一）細(xì)菌的基本形態(tài)觀察（二）細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)觀察

（一）細(xì)菌的基本形態(tài)觀察

使用顯微鏡油鏡，觀察各種球菌、桿菌和螺形菌的革蘭染色標(biāo)本片，以認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)。觀察時(shí)應(yīng)注意細(xì)菌的形狀、大小、排列方式、染色性，同時(shí)繪圖記錄。

1．球菌①葡萄球菌：菌體正圓形，呈葡萄串狀排列，染成紫藍(lán)色，為革蘭染色陽性球菌；②鏈球菌：菌體正圓形，呈鏈狀排列，染成紫藍(lán)色，革蘭染色陽性球菌；③腦膜炎奈瑟菌：菌體腎形，成雙排列，染成紅色，為革蘭染色陰性球菌。

2.桿菌大腸埃希菌，菌體短桿狀，呈分散排列，染成紅色，為革蘭染色陰性桿菌。３.螺形菌霍亂弧菌，菌體呈弧形，呈分散排列，染成紅色，為革蘭染色陰性弧菌。

（二）細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)觀察

觀察示教鏡下傷寒沙門菌的鞭毛、肺炎鏈球菌的莢膜、破傷風(fēng)梭菌的芽孢。注意細(xì)菌菌體與特殊結(jié)構(gòu)的形狀、染色性、大小、位置等形態(tài)特點(diǎn)，并繪圖。１．鞭毛傷寒沙門菌鞭毛染色標(biāo)本片，菌體較粗大、桿狀，染成紅色，分散排列，周圍可見到波浪狀彎曲、較長(zhǎng)、呈紅色的鞭毛。2．莢膜肺炎鏈球菌莢膜染色標(biāo)本片，視野背景為藍(lán)色，菌體呈縱向成雙排列呈雙瓜子狀或鏈狀，菌體周圍有未染上顏色的空白發(fā)光區(qū)，即莢膜。3．芽孢①破傷風(fēng)梭菌芽孢的革蘭染色標(biāo)本片，菌體為革蘭染色陽性長(zhǎng)桿狀，頂端有不著色的圓形空白區(qū)，并大于菌體寬度即芽孢，似“鼓槌狀”，視野中其他散亂分布的無色球體，為菌體脫落的成熟芽孢。②炭疽芽孢桿菌革蘭染色標(biāo)本片，菌體粗大桿狀，呈鏈狀排列，似竹節(jié)狀，染成紫色，為革蘭染色陽性桿菌。菌體中間有卵圓形的小于菌體的芽孢

三．細(xì)菌涂片標(biāo)本制作和革蘭染色法(操作)（一）革蘭染色法原理 （二）實(shí)驗(yàn)材料 （三）實(shí)驗(yàn)方法

（一）革蘭染色法原理

由于細(xì)菌的等電點(diǎn)低（在PH2～5之間）且?guī)ж?fù)電荷以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異等原因，革蘭染色陽性菌可牢固結(jié)合帶正電荷的堿性結(jié)晶紫，不易被酒精脫色，故仍保持初染的紫藍(lán)色；革蘭染色陰性菌等電點(diǎn)較革蘭陽性菌等電點(diǎn)高，結(jié)合結(jié)晶紫不牢固，易被酒精脫色．故復(fù)染呈紅色。

（二）實(shí)驗(yàn)材料

1．菌種大腸埃希菌、葡萄球菌培養(yǎng)物。2．其他革蘭染色液、載玻片、生理鹽水、香柏油、酒精燈、接種環(huán)、擦鏡紙、火柴等。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1．制片細(xì)菌涂片標(biāo)本制作的基本步驟為：

①涂片：取生理鹽水各一滴，滴于玻片兩側(cè)，以無菌操作的方法，用無菌接種環(huán)挑起培養(yǎng)基上葡萄球菌培養(yǎng)物少許，在玻片一側(cè)的鹽水中磨勻，涂布成約1cm×1cm大小的圓形薄膜；再用無菌接種環(huán)挑起培養(yǎng)基上大腸桿菌培養(yǎng)物少許，在玻片另一側(cè)的鹽水中磨勻，也涂布成約1cm×1cm大小的圓形薄膜。

②干燥：把涂好的玻片置于室溫中自然干燥，或?qū)⒕っ娉现糜诰凭珶艋鹧嫔戏讲豢臼值母咛幬⑽⒑娓伞?/p>

③固定：將已干燥的涂片膜面向上，玻片與酒精燈火焰接觸，在火焰外焰上水平地快速來回通過火焰3次，予以固定，注意不可將菌體烤焦。把固定好的玻片置于染色槽上冷卻，待冷卻后進(jìn)行染色。

2．染色

（1）初染：滴加結(jié)晶紫染液于涂膜上，染色1min后，用水輕輕沖洗。

（2）媒染：滴加碘液，約1min后，水洗。

（3）脫色：滴加95％乙醇溶液脫色，輕輕搖動(dòng)玻片至無紫色脫出為止，0.5～lmin后(視涂片的厚薄程度而定)，水洗。

（4）復(fù)染：滴加釋稀復(fù)紅，染色0.5～1min后，水洗。3．鏡檢將標(biāo)本片用吸水紙吸干，加一滴香柏油后用顯微鏡油鏡觀察。4．結(jié)果葡萄球菌染成紫藍(lán)色，為革蘭陽性菌；大腸桿菌染成紅色，為革蘭陰性菌。

【實(shí)驗(yàn)作業(yè)】

(1)列出顯微鏡油鏡頭的三個(gè)標(biāo)志。(2)寫出油鏡使用時(shí)采光的方法要點(diǎn)。(3)繪出鏡下所見的細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)圖。

(4)記錄革蘭染色的結(jié)果，并進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的培養(yǎng)與代謝產(chǎn)物觀察（示教）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1.掌握固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基的用途。 2.熟悉細(xì)菌在固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)現(xiàn)象。 3.了解細(xì)菌的接種技術(shù)及無菌操作技術(shù)概念 4.了解基礎(chǔ)培養(yǎng)基制作的過程

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法】

一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制作二、細(xì)菌接種法與培養(yǎng)三、觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象四、細(xì)菌代謝產(chǎn)物的觀察

一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基按物理性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基三種。培養(yǎng)基的制備程序可分：配料→溶化→測(cè)定及矯正pH→過濾→分裝→滅菌→檢定→保存?zhèn)溆谩?/p>

（一）肉膏湯培養(yǎng)基1.成分：牛肉膏0.3g 蛋白胨1g 氯化鈉0.5g 蒸餾水100ml2.制法： （1）用天平分別稱取牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化鈉0.5g置三角燒瓶中。 （2）加入蒸餾水100毫升，把三角燒瓶用酒精燈或電爐加熱，使蛋白胨等溶解。 （3）測(cè)定培養(yǎng)基的酸堿度。調(diào)整至pH7.6(可用pH試紙測(cè)定)。必要時(shí)用濾紙過濾。 （4）分裝試管或燒瓶，塞上棉塞，用玻璃紙包扎管口、瓶口。 （5）高壓蒸汽滅菌103.42kPa20min取出冷卻后冰箱貯存?zhèn)溆谩?.用途：肉膏湯培養(yǎng)基主要用于增菌。

（二）固體培養(yǎng)基1.成分：肉膏湯培養(yǎng)基100ml

瓊脂2g~3g2.制法： （1）在上述制備的肉湯中加入瓊脂。瓊脂為海藻中提取的一種多糖類物質(zhì)，本身無營養(yǎng)作用，不能被細(xì)菌利用。因其加熱到85℃后可溶化，冷卻至40℃左右又可凝固，故可作為固形劑。加熱使所有的瓊脂全部溶化，以紗布和脫脂棉過濾，補(bǔ)足蒸發(fā)的水，分裝三角燒瓶和試管。 （2）置高壓滅菌器內(nèi)103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸氣壓力下，滅菌20min，取出后趁熱將試管傾斜一定角度放置，待瓊脂凝固即成瓊脂斜面培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)圖2-1）。三角燒瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基冷至50℃～60℃時(shí)在超凈臺(tái)或無菌室內(nèi)將其傾注于滅菌平皿內(nèi)（15ml～20ml），凝固后即成瓊脂平板，放置冰箱中備用。

3.用途：普通瓊脂培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的分離、鑒定、計(jì)數(shù)、保存菌種。

（三）半固體培養(yǎng)基1.成分：肉膏湯培養(yǎng)基100ml瓊脂

0.5～1g2.制法：

（1）將0.5g～1g瓊脂加到100ml肉膏湯中，加熱溶化，調(diào)整至PH7.6。 （2）分裝試管，每管約2ml～3ml，滅菌后使試管直立，冷凝后即成半固體培養(yǎng)基。3.用途：半固體培養(yǎng)基用于保存菌種或觀察細(xì)菌的動(dòng)力。

二、細(xì)菌接種法與培養(yǎng)（一）平板分區(qū)劃線接種法（二）斜面培養(yǎng)基接種法（三）液體培養(yǎng)基接種法（四）半固體培養(yǎng)基接種法

（一）平板分區(qū)劃線接種法

該法多用于獲得細(xì)菌的純種。

1.標(biāo)記在培養(yǎng)皿底玻璃上，用記號(hào)筆注明接種的菌名、接種者姓名、班級(jí)、日期等。

2.滅菌接種環(huán)點(diǎn)燃酒精燈，右手以持筆式握持接種環(huán)并放置酒精燈的火焰中燒灼至通紅滅菌，如實(shí)驗(yàn)圖2-2，先將接種環(huán)的接種絲部分置于火焰中，待金屬絲燒紅并蔓延至金屬環(huán)端，再直接燒灼金屬環(huán)直至燒紅，然后由金屬環(huán)至金屬桿方向快速通過火焰，隨后再反方向通過火焰，如此2～3次。然后將接種環(huán)移開火焰，待其冷卻。注意，接種環(huán)不能距離火焰過遠(yuǎn)，一般應(yīng)在距火焰10cm范圍之內(nèi)（視此范圍為無菌環(huán)境）；滅菌后的接種環(huán)不能再碰其它物體。

實(shí)驗(yàn)圖2-2接種環(huán)的滅菌操作

3.取菌種左手持裝有葡萄球菌和大腸桿菌混合菌液的試管，用持有接種環(huán)的右手手掌及小指拔取試管硅膠塞，將試管管口迅速通過火焰外焰2～3次進(jìn)行滅菌。將已滅菌且已冷卻的接種環(huán)伸入菌種管中，取一接種環(huán)的混合菌液，然后退出菌種管。將菌種管管口再次通過火焰外焰2～3次滅菌，塞好硅膠塞，放至原來的位置。

4.分區(qū)劃線接種細(xì)菌（實(shí)驗(yàn)圖2-3）實(shí)驗(yàn)圖2-3分區(qū)劃線接種細(xì)菌

（1）左手持平板培養(yǎng)基，在火焰上方打開平皿蓋，打開角度不能超過45°，將挑取菌種的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基的邊緣部分涂抹，接種環(huán)燒灼、冷卻，自涂抹部分開始，做不重疊來回連續(xù)劃線，第一區(qū)劃線面積約占平板的1/4。 （2）再次燒灼滅菌接種環(huán)，冷卻，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)動(dòng)80°左右，進(jìn)行第二區(qū)劃線，第二區(qū)劃線與第一區(qū)劃線有2～3條相交。燒灼接種環(huán)后用相同的方法進(jìn)行第三區(qū)、第四區(qū)劃線。 （3）接種環(huán)燒灼滅菌，接種完畢。在平板底部作上記號(hào)，放入37℃溫箱中培育24h后觀察結(jié)果。注意觀察最后1～2區(qū)內(nèi)是否分離出單個(gè)菌落，并觀察記錄菌落特征（如菌落大小、形狀、邊緣、表面、顏色、透明度等情況）。

（二）斜面培養(yǎng)基接種法

斜面培養(yǎng)基多用于純種增菌。 1.在待接種的瓊脂斜面培養(yǎng)基試管壁上貼上標(biāo)簽紙，作好標(biāo)記。 2.以無菌操作，用滅菌的接種環(huán)從發(fā)給的菌種上取菌少許（如為瓊脂平板培養(yǎng)物應(yīng)取單個(gè)菌落）。 3.按無菌操作手續(xù)，將所取細(xì)菌自瓊脂斜面的底部向上輕輕作曲線劃線接種。置37℃溫箱培養(yǎng)18～24h。 4.觀察結(jié)果并記錄。

（三）液體培養(yǎng)基接種法

1.在待接種肉湯管上寫明標(biāo)記或貼上標(biāo)簽。 2.左手握持菌種管及待接種的肉湯管，菌種管在外側(cè)。 3.傾斜肉湯管，接種環(huán)滅菌冷卻后，伸入菌種管取少量細(xì)菌再伸入肉湯管內(nèi)，在接近液面管壁處輕輕研磨，使菌混于肉湯中。塞好試管硅膠塞后，輕輕搖動(dòng)液體，使細(xì)菌在液體中均勻分布。 4.接種完畢，將接種環(huán)滅菌后放回試管架上。肉湯管放37℃溫箱培養(yǎng)，18～24h后觀察生長(zhǎng)情況（觀察液體有無混濁、沉淀、顆粒狀、菌膜、色澤等）。

（四）半固體培養(yǎng)基接種法

半固體培養(yǎng)基用于觀察細(xì)菌有無動(dòng)力或保存菌種。有動(dòng)力的細(xì)菌除在穿刺線上生長(zhǎng)外，還可以向四周彌散生長(zhǎng)，使整個(gè)培養(yǎng)基變混濁或呈羽絨狀；而無動(dòng)力的細(xì)菌只沿著穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線以外的培養(yǎng)基仍澄清。 此試驗(yàn)分2組，一組用葡萄球菌或痢疾桿菌，另一組用枯草桿菌或大腸桿菌。 1.在待接種的半固體培養(yǎng)基試管上貼好標(biāo)簽。 2.與液體培養(yǎng)基接種法相同，左手握持菌種管及待接種的半固體瓊脂培養(yǎng)基。 3.右手持接種針，滅菌冷卻后，以針挑取菌苔，從半固體培養(yǎng)基的中心垂直刺入，達(dá)底部（但不能與管底接觸，距離管底約4mm），然后沿原穿刺線路退出（實(shí)驗(yàn)圖2-4）。 4.接種完畢，接種針重新滅菌后放至試管架上，塞好硅膠塞，37℃培養(yǎng)18—24h小時(shí)后取出觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況并記錄。

實(shí)驗(yàn)圖2-4斜面、液體、半固體培養(yǎng)基接種法

三、觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象（一）固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)現(xiàn)象（二）液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象（三）半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象

（一）固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)現(xiàn)象 標(biāo)本或培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個(gè)細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落。多個(gè)菌落密集生長(zhǎng)融合連成一片叫菌苔。注意觀察菌落的大小、形態(tài)、透明度、顏色、濕潤(rùn)度、表面是否光滑或凸起或凹陷，邊緣是否整齊及菌落周圍有無溶血環(huán)等。

（二）液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有三種生長(zhǎng)現(xiàn)象：

均勻混濁（葡萄球菌）沉淀生長(zhǎng)（鏈球菌）

形成菌膜（枯草芽胞桿菌）

（三）半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象

有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長(zhǎng)外，在穿刺線周圍可見羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng)（枯草桿菌或大腸桿菌），動(dòng)力陽性。無鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長(zhǎng)，穿刺線周圍的培養(yǎng)基仍然澄清透明（痢疾桿菌或葡萄球菌），動(dòng)力陰性。 細(xì)菌在固體、液體和半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象（實(shí)驗(yàn)圖2-5）。

實(shí)驗(yàn)圖2-5細(xì)菌在固體、液體和半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象

四、細(xì)菌代謝產(chǎn)物的觀察（一）細(xì)菌對(duì)糖類發(fā)酵作用——糖發(fā)酵試驗(yàn)（二）細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)或氨基酸的分解作用（三）尿素分解試驗(yàn)（四）色素的產(chǎn)生

（一）細(xì)菌對(duì)糖類發(fā)酵作用——糖發(fā)酵試驗(yàn)

取葡萄糖,乳糖發(fā)酵管各二支（注意管內(nèi)的小倒管應(yīng)充滿液體，不含氣泡），各管分別接種大腸桿菌、傷寒桿菌，種畢，置37℃培養(yǎng)18～24h，取出看結(jié)果，并以下列符號(hào)作記錄：

：表示分解糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養(yǎng)基指示劑（溴甲酚紫）由紫色變黃色，小倒管內(nèi)有氣泡。 +：表示分解糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。 －：表示不分解糖，不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

（二）細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)或氨基酸的分解作用

1.吲哚試驗(yàn)：取蛋白胨水培養(yǎng)基二支，分別接種大腸桿菌與傷寒桿菌，種畢，置37℃培養(yǎng)18～24h，取出檢查。沿管壁徐徐加入約0.5ml的吲哚（靛基質(zhì)）試劑于培養(yǎng)物中，若見試劑與培養(yǎng)基的接觸面出現(xiàn)紅色，則試驗(yàn)為陽性；若不出現(xiàn)紅色，則試驗(yàn)為陰性，記錄結(jié)果。

2.硫化氫試驗(yàn)：取醋酸鉛培養(yǎng)基二支，分別接種大腸桿菌與變形桿菌或乙型副傷寒桿菌，種畢，置37℃培養(yǎng)18～24h。取出觀察結(jié)果，按下列符號(hào)記錄：+：出現(xiàn)黑色，表示產(chǎn)生硫化氫。－：顏色不變，表示不產(chǎn)生硫化氫。

（三）尿素分解試驗(yàn)

尿素培養(yǎng)基的主要成分：尿素水溶液、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、酚紅（指示劑）。培養(yǎng)基呈淡紅色。 某些細(xì)菌（如變形桿菌）具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氮，使培養(yǎng)基變堿性，指示劑呈紅色（陽性反應(yīng)）；不分解尿素者（如傷寒桿菌），培養(yǎng)基顏色不變（陰性反應(yīng)）。尿素培養(yǎng)基中含有的葡萄糖、蛋白胨，供作接種菌的營養(yǎng)物，兩者的量有一定比例，使分解葡萄糖生成的酸和分解蛋白胨生成的堿性化合物基本相互抵消；同時(shí)培養(yǎng)基中尚有磷酸二氫鉀緩沖劑的存在，故此兩物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)基的酸堿度影響不大。如接種的細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸過多，使pH值下降，也可使培養(yǎng)基顏色變黃。 取尿素培養(yǎng)基二支，分別接種傷寒桿菌和變形桿菌，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果并作記錄。

（四）色素的產(chǎn)生

取普通瓊脂斜面（或平碟）培養(yǎng)基2支（個(gè)），分別接種金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌于培養(yǎng)基上，種畢，放37℃培養(yǎng)18～24h取出觀察是否有色素產(chǎn)生，并作記錄。

【實(shí)驗(yàn)作業(yè)】1．寫出各種培養(yǎng)基制備的方法。2．寫出三種培養(yǎng)基的用途。3.記錄細(xì)菌在普通平板,液體培養(yǎng)基,半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象。4.說明在接種細(xì)菌時(shí)要注意哪些無菌操作。

實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的檢查及消毒滅菌（操作）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.掌握：無菌操作技術(shù)。

2.熟悉：高壓滅菌器的使用及使用注意事項(xiàng)；紫外線滅菌。

3.了解：細(xì)菌的接種技術(shù)；藥敏試驗(yàn)在臨床應(yīng)用的實(shí)際意義。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法】一、細(xì)菌的分布檢查二、咽喉部細(xì)菌的檢查及皮膚消毒試驗(yàn)三、常用消毒滅菌器介紹（示教）四、藥物敏感試驗(yàn)（紙片法）（示教）

一、細(xì)菌的分布檢查

（一）空氣中細(xì)菌的檢查

取普通瓊脂平板2個(gè)，分別置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和消毒過的無菌室或超凈工作臺(tái)上，打開平皿蓋暴露10分鐘，蓋上平皿蓋，做好標(biāo)記，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。

（二）水中細(xì)菌分布檢查——傾注平板分離法

1．取已滅菌的1毫升吸管，套上膠頭。 2．右手持吸管帶膠頭的一端，其余部分迅速通過火焰外焰，以再滅除吸管表面可能存在的細(xì)菌。 3．以擠壓膠頭的辦法，吸取1ml自來水，置于無菌空平皿中（注意不要錯(cuò)放入平碟蓋內(nèi)）。 4．取一瓶已融化并冷卻至50℃左右（手握瓊脂管感覺熱而不燙手）的瓊脂培養(yǎng)基，取去硅膠塞，管口通過火焰外焰滅菌，迅速傾入已盛有1ml自來水的平皿中，立即加上平皿蓋，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上輕輕水平搖動(dòng)，使瓊脂與水樣充分混合，靜置臺(tái)面，等待瓊脂凝固。

5．瓊脂凝固后，將平皿倒放（即平皿底在上，蓋在下）。置于37℃溫箱培養(yǎng)18～24h，取出觀察結(jié)果。計(jì)算每毫升自來水菌落數(shù)，對(duì)結(jié)果給予評(píng)價(jià)。

二、咽喉部細(xì)菌的檢查及皮膚消毒試驗(yàn)

（一）咽喉部細(xì)菌的檢查

取血平板1個(gè)，在平皿底部正中畫一直線分為兩部分，分別做好標(biāo)記，由兩位同學(xué)用無菌操作分別將咽喉部棉拭子標(biāo)本涂于血平皿表面的相應(yīng)位置，然后再用接種環(huán)畫線分離，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果（注意是否有細(xì)菌菌落、菌苔及溶血環(huán)）。

（二）皮膚消毒試驗(yàn)

每?jī)擅麑W(xué)生用一個(gè)瓊脂平皿，先在平皿底部帖上標(biāo)簽紙，紙上分5格，標(biāo)明序號(hào)，兩人用未消毒手指分別在1、2格內(nèi)涂布，然后用2%碘酊消毒手指后再分別涂抺3、4格，余下第5格作為空白對(duì)照，蓋上皿蓋，置37℃溫箱培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

三、常用消毒滅菌器介紹（示教）（一）高壓蒸汽滅菌器（二）干烤箱（干熱滅菌器）（三）紫外線殺菌試驗(yàn)

（一）高壓蒸汽滅菌器

高壓蒸汽滅菌器是應(yīng)用最廣的滅菌器，凡能耐高溫不怕潮濕的普通培養(yǎng)基、敷料、手術(shù)器械、藥品、注射用液體和玻璃器皿等，均可用此法滅菌。

1.高壓蒸汽滅菌器的構(gòu)造：手提式蒸汽滅菌器是一雙層金屬圓桶。外層堅(jiān)厚，能承受一定的壓力，外層頂端有金屬厚蓋。有的滅菌器蓋旁加有螺旋，借以緊閉此蓋，有的則借助彈力將蓋頂上，防止蒸汽外溢。蓋上裝有排氣閥門、內(nèi)連通氣管、安全活塞和溫度壓力表。內(nèi)層金屬筒的內(nèi)壁有安置通氣管的金屬槽。（見實(shí)驗(yàn)圖3－1）

實(shí)驗(yàn)圖3－1手提式高壓蒸汽滅菌器示意圖

2.高壓蒸汽滅菌器使用法：

（1）先在外層內(nèi)加適當(dāng)?shù)乃缓蠓湃雰?nèi)層金屬筒。將待滅菌物品放入內(nèi)層金屬筒里，加蓋，注意要把蓋上的通氣管放入內(nèi)壁金屬槽內(nèi)。旋緊螺旋使之密閉，同時(shí)打開排氣閥門。 （2）放爐上加熱或插上電源。 （3）溫度逐漸上升時(shí)，裝入的水汽化，隨著壓力的增高，迫使器內(nèi)冷空氣先由排氣閥驅(qū)出，繼則有蒸汽出現(xiàn)，待有大量蒸汽噴出時(shí)（呈白色霧狀氣流，并發(fā)出哨音）即可認(rèn)為器內(nèi)冷空氣已被排盡。 （4）關(guān)閉排氣閥門，此后器內(nèi)壓力逐漸升高。隨著蒸汽壓力的增高，內(nèi)部溫度也隨之升高。溫度隨壓力升高的情況見實(shí)驗(yàn)表3-1。直到壓力表指示到103kpa(15磅／吋2)時(shí)，器內(nèi)溫度可達(dá)到121.3℃。此時(shí)調(diào)節(jié)熱源使壓力和溫度維持在此數(shù)值，維持15～20min，即可達(dá)到滅菌的目的。（5）滅菌時(shí)間達(dá)到后，停止加熱，待壓力自行下降至零時(shí)，才能開蓋取物。

3.使用高壓蒸汽滅菌器注意事項(xiàng)：

（1）滅菌開始時(shí)，必須將器內(nèi)冷空氣完全排除，否則壓力表上所示壓力不完全是蒸汽壓力，滅菌將不徹底。 （2）滅菌完畢，切不可突然打開排氣閥門放氣減壓，以免滅菌的瓶?jī)?nèi)液體因壓力突然降低后沖出外溢。 （3）放置需滅菌的物品不應(yīng)太擠。根據(jù)物品體積的大小或污染的情況可適當(dāng)調(diào)整滅菌時(shí)間。總之用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí)，要做到“安全生產(chǎn)”。

（二）干烤箱（干熱滅菌器）

干烤箱是用兩層金屬板制成的箱子，中間充以石棉，箱底有熱源（電爐），并附有溫度計(jì)和自動(dòng)調(diào)節(jié)器。滅菌時(shí)，加熱箱內(nèi)空氣，靠熱空氣滅菌。主要用于耐高溫，怕潮濕的物品滅菌。如玻璃器皿、試管、吸管、三角燒杯、油劑、粉劑等滅菌。用時(shí)將需滅菌的物品經(jīng)清洗和晾干之后，整齊排放在箱內(nèi)，不宜過擠，關(guān)閉兩層箱門，通電，排冷氣后關(guān)上排氣孔，待溫度升到160～170℃，維持2h，可達(dá)到滅菌目的。滅菌完畢，關(guān)閉電源，待溫度自然下降至50℃以下才能開門取物，以防玻璃器皿驟冷發(fā)生爆裂。

（三）紫外線殺菌試驗(yàn)

原理：紫外線在波長(zhǎng)200nm～300nm時(shí)具有殺菌能力，但穿透力不強(qiáng)，可被普通玻璃及紙片所吸收。用途：常用于手術(shù)室、無菌室、病房、治療室等的空氣消毒。 取普通瓊脂平板一個(gè)，均勻密集畫線接種大腸桿菌，用無菌鑷子把經(jīng)滅菌的方形紙片帖于平板表面中央部分。打開平皿蓋，置紫外線燈下距離20～30cm處照射30分鐘，除去紙片，蓋好平皿蓋，置37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。

四、藥物敏感試驗(yàn)（紙片法）（示教）

（一）取瓊脂平板2個(gè)，大腸桿菌斜面培養(yǎng)物及葡萄球菌斜面培養(yǎng)物各1支。 （二）將大腸桿菌密集劃線接種在整個(gè)平皿表面上，使細(xì)菌均勻密集地分布于整個(gè)平皿。用同法將葡萄球菌接種于另一平皿。 （三）無菌操作用鑷子取藥敏紙片，按標(biāo)記位置帖在涂布細(xì)菌的培養(yǎng)基表面，用鑷尖壓一下，使其帖平，一次帖好，不得移動(dòng)。紙片一帖上就不可再拿起，因紙片中的藥液已擴(kuò)散到瓊脂中。每張紙片中心間距不少于24mm，紙片中心距平板邊線距離不少于15mm。直徑為90mm的平皿最多帖6片。 （四）帖上紙片后，須在15分鐘內(nèi)置37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)后觀察并記錄結(jié)果。

（五）結(jié)果報(bào)告測(cè)量抑菌圈（無細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)）的直徑，結(jié)合藥物的性質(zhì)，一般以敏感、中度敏感、耐藥三個(gè)等級(jí)報(bào)告結(jié)果。（見實(shí)驗(yàn)圖3－2）

實(shí)驗(yàn)圖3－2藥物敏感試驗(yàn)

敏感（S）：指細(xì)菌被常用劑量的抗菌藥物所抑制。

中介（I）：指細(xì)菌被高于常用劑量的抗菌藥物所抑制，但治療指數(shù)低（即治療量與中毒量接近）；或者是敏感與耐藥之間的緩沖帶，為實(shí)驗(yàn)誤差造成。 耐藥（R）：指細(xì)菌不被常用劑量的抗菌藥物所抑制，治療效果差。不同細(xì)菌對(duì)相同或不同藥物的敏感度可有不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)（見實(shí)驗(yàn)表3－2）

實(shí)驗(yàn)表3－2常用藥敏實(shí)驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌抗菌藥物抑菌圏直徑（mm）

R

IS 葡萄球菌青霉素≤28－≥29 紅霉素≤1314～22≥23 氨芐西林≤28－≥29 頭孢唑啉≤1415～17≥18 慶大霉素≤1213～14≥15 四環(huán)素≤1415～18≥19 環(huán)丙沙星≤1516～20≥21 磺胺藥≤1213～16≥17 腸桿菌科氨芐西林≤1314～16≥17 頭孢唑啉≤1415～17≥18 慶大霉素≤1213～14≥15 四環(huán)素≤1415～18≥19 環(huán)丙沙星≤1516～20≥21 磺胺藥≤1213～16≥17

【實(shí)驗(yàn)作業(yè)】1.記錄并分析空氣中、水的、物品上、咽喉部細(xì)菌的分布檢查結(jié)果。2.記錄并分析煮沸消毒、紫外線殺菌、皮膚消毒的消毒滅菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.記錄并分析紙片法藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)四免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握玻片凝集反應(yīng)的原理、方法及結(jié)果判定2.熟悉胎兒胸腺、骨髓、雛雞腔上囊、淋巴結(jié)、脾臟的形態(tài)與功能3.熟悉吞噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象4.E-花環(huán)試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)用途；HCG的檢測(cè)方法及臨床意義5.了解豚鼠過敏性休克的表現(xiàn)與原理6.了解試管凝集反應(yīng);ELISA雙抗體夾心法；常用生物制品觀察

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法】一、免疫器官與免疫細(xì)胞的觀察（示教）二、豚鼠過敏性休克的觀察（示教）三、抗原抗體反應(yīng)四、常用生物制品觀察（示教）

實(shí)驗(yàn)四免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握玻片凝集反應(yīng)的原理、方法及結(jié)果判定2.熟悉胎兒胸腺、骨髓、雛雞腔上囊、淋巴結(jié)、脾臟的形態(tài)與功能3.熟悉吞噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象4.E-花環(huán)試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)用途；HCG的檢測(cè)方法及臨床意義5.了解豚鼠過敏性休克的表現(xiàn)與原理6.了解試管凝集反應(yīng);ELISA雙抗體夾心法；常用生物制品觀察

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法】一、免疫器官與免疫細(xì)胞的觀察（示教）二、豚鼠過敏性休克的觀察（示教）三、抗原抗體反應(yīng)四、常用生物制品觀察（示教）

一、免疫器官與免疫細(xì)胞的觀察（示教）（一）胎兒胸腺、骨髓、雛雞腔上囊、淋巴結(jié)、脾臟標(biāo)本觀察（二）吞噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象鏡下標(biāo)本觀察（三）E花環(huán)與T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)鏡下標(biāo)本觀察

（一）胎兒胸腺、骨髓、雛雞腔上囊、淋巴結(jié)、脾臟標(biāo)本觀察1.觀察4～6個(gè)月齡胎兒胸腺標(biāo)本。胸腺位于胸骨柄的后方，上縱隔的前部，由不對(duì)稱的左右兩葉組成，中間可見一條正中線。胸腺是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場(chǎng)所。2.觀察骨髓標(biāo)本。骨髓是各種血細(xì)胞和免疫細(xì)胞發(fā)生和分化的場(chǎng)所，在哺乳類動(dòng)物中，骨髓是B細(xì)胞產(chǎn)生、分化與成熟的器官。3.觀察雛雞腔上囊標(biāo)本。腔上囊位于泄殖腔后上方，為一囊狀淋巴組織，是鳥類B細(xì)胞產(chǎn)生、分化與成熟的器官。4.觀察淋巴結(jié)和脾臟標(biāo)本。淋巴結(jié)和脾臟均為外周免疫器官，是成熟T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞定居的場(chǎng)所，也是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的部位。

（二）吞噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象鏡下標(biāo)本觀察

用油鏡觀察被中性粒細(xì)胞吞噬的細(xì)菌和被巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞的染色標(biāo)本。

1．中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的染色標(biāo)本片

中性粒細(xì)胞核和細(xì)菌經(jīng)瑞氏染色被染成紫色，中性粒細(xì)胞的胞漿被染成淡紅色。稱為小吞噬現(xiàn)象。

2．巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的染色標(biāo)本片

巨噬細(xì)胞經(jīng)瑞氏染色后核著色較深，多為馬蹄形，胞漿著色較淺。雞紅細(xì)胞為橢圓形，核淡紅色。稱為大吞噬現(xiàn)象。

（三）E花環(huán)與T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)鏡下標(biāo)本觀察

1.油鏡觀察E花環(huán)試驗(yàn)染色標(biāo)本片T細(xì)胞染成紫藍(lán)色，核呈圓形，染色質(zhì)呈塊狀，排列致密，胞質(zhì)為新月形；其周圍結(jié)合3個(gè)或3個(gè)以上染成紅色的綿羊紅細(xì)胞。（彩圖4-1）正常值為50%～70%左右。

2.油鏡觀察淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)染色標(biāo)本片

注意未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞與轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞的不同形態(tài)特征。轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞包括母細(xì)胞和過渡型細(xì)胞。母細(xì)胞的特點(diǎn)為正常細(xì)胞的4～5倍，核疏松呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并有1～3個(gè)核仁，胞漿豐富，嗜堿性，并可見空泡。過渡型細(xì)胞較正常細(xì)胞略大，核質(zhì)較疏松，胞漿較多，嗜堿性。正常值為50～80%。

二、豚鼠過敏性休克的觀察（示教）實(shí)驗(yàn)方法1.致敏注射取體重250克的豚鼠2只（其中1只為備用），每只腹腔或皮下注射1：10稀釋的雞蛋清溶液0.5ml，使之致敏，做好標(biāo)記。2.發(fā)敏注射取致敏注射2～3周的豚鼠1只，心內(nèi)注射1：2稀釋的雞蛋清溶液1ml；取未致敏的豚鼠1只，心內(nèi)注射1：2稀釋的雞蛋清溶液1ml，作為對(duì)照。3.結(jié)果觀察致敏豚鼠經(jīng)發(fā)敏注射后數(shù)分鐘，出現(xiàn)不安、豎毛、搔鼻、噴嚏、呼吸困難、抽搐、大小便失禁及痙攣性跳躍等反應(yīng)，嚴(yán)重者死亡，解剖可見肺氣腫。（實(shí)驗(yàn)圖4－1）

實(shí)驗(yàn)圖4－1豚鼠過敏性休克

三、抗原抗體反應(yīng)（一）玻片凝集反應(yīng)（操作） （二）試管凝集反應(yīng)（示教）（三）早孕檢測(cè)（四）ELISA雙抗體夾心法（示教）

（一）玻片凝集反應(yīng)（操作） 1.材料：（1）診斷血清：1：10稀釋的傷寒桿菌診斷血清（2）菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物（3）生理鹽水、載玻片、毛細(xì)吸管

2.方法：（1）取清潔玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號(hào)碼。無菌操作下，用接種環(huán)于1、2格內(nèi)分別加1：10稀釋傷寒桿菌診斷血清1～2滴，第三格加1～2滴生理鹽水。（2）無菌操作下，用接種環(huán)取傷寒桿菌培養(yǎng)物少許，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因?yàn)檫@樣將使診斷血清混入鹽水而影響對(duì)照結(jié)果），將細(xì)菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時(shí)取菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。（3）同法取痢疾桿菌培養(yǎng)物少許，于第二格內(nèi)混勻。（4）輕輕搖動(dòng)玻片，經(jīng)1～2min后肉眼觀察有無凝集塊

3.結(jié)果判斷出現(xiàn)粉末狀乳白色凝集塊者，即為陽性反應(yīng)；仍為均勻的乳濁液者，即為陰性反應(yīng)。如結(jié)果不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察（實(shí)驗(yàn)圖4－2）。實(shí)驗(yàn)圖4－2玻片凝集試驗(yàn)

（二）試管凝集反應(yīng)（示教）

試管凝集試驗(yàn)為半定量試驗(yàn)方法。用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清（被檢抗體）混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)，亦稱為滴度。在試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和pH不適當(dāng)?shù)仍颍梢鹂乖姆翘禺愋阅霈F(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對(duì)照組。

1.材料（1）1∶10稀釋的傷寒桿菌免疫血清。（2）傷寒桿菌“O”菌液、傷寒桿菌“H”菌液。（3）生理鹽水、小試管、吸管、試管架、水浴箱。

2.方法（1）取潔凈小試管14支，依次用蠟筆標(biāo)明管號(hào)。（2）用5亳升吸管取生理鹽水，于每管中分別加入0.5亳升。（3）用1亳升吸管取傷寒桿菌血清1亳升，分別加入兩排的第1管中，每管0.5亳升。（4）從第1管開始用上述吸管交血清生理鹽水反復(fù)吹吸三次混勻，由第2管吸出0.5亳升加入第2管中，同法吹吸混勻后的吸出0.5亳升加入第3管中，如此二倍稀釋法至第6管，再從第6管吸出0.5亳升棄去，第7管不加血清，作為對(duì)照，此時(shí)血清稀釋倍數(shù)為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶640。（實(shí)驗(yàn)圖4－3）（5）將第二排同樣方法稀釋。見實(shí)驗(yàn)圖4－3。（6）用5亳升吸管吸取傷寒桿菌“O”菌液，加入第一排各管中，每管0.5亳升（由最后一管依次向前加入）。此時(shí)血清以被稀釋一倍。（7）另取一支5亳升吸管吸取傷寒桿菌“H”菌液，同樣方法另入第二排各管中，每管0.5亳升。（8）用手搖管架數(shù)次，使各管液體混勻，放56℃水浴箱中2小時(shí)或37℃溫箱中過夜，觀察結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)圖4－3

血清對(duì)倍稀釋示意圖

3.觀察結(jié)果時(shí)注意（1）自水浴箱中取出后，切忌搖動(dòng)試管。先觀察鹽水對(duì)照管，管底沉淀物呈圓形，邊緣整齊，輕輕振搖，細(xì)菌分散仍呈混濁現(xiàn)象。（2）試管應(yīng)由第一管看起。如有凝集，可見管底有沉淀凝集塊，邊緣不整齊，液體上部澄清。“O”菌液的凝集呈顆粒狀，不易搖碎。“H”菌液的凝集呈棉絮狀，輕搖即升起。（3）凝集強(qiáng)弱，判定以“+”號(hào)表示如下： “++++”——很強(qiáng)，細(xì)菌全部凝集，菌液澄清，輕搖有大片凝集塊。 “+++”——強(qiáng)，細(xì)菌絕大部分凝集，液體有輕度混濁，凝集塊較小。 “++”——中等強(qiáng)度，細(xì)菌部分凝集于管底，液體半澄清，凝集塊小。 “+”——弱，細(xì)菌僅少量凝集，液體混濁。 “––”不凝集，液體混濁與對(duì)照管相似。（4）凝集效價(jià)的判定：血清的最高稀釋倍數(shù)呈明顯凝集（++）者，為該血清的凝集效價(jià)，用稀釋倍數(shù)表示之。

（三）早孕檢測(cè)1.方法取HCG金標(biāo)試紙條（早孕試驗(yàn)試劑）3條，分別將白色一端插入陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、待檢尿液中，使用時(shí)尿液面不超過Max線，5s后取出平放，3min內(nèi)觀察結(jié)果。2.結(jié)果判斷出現(xiàn)1條紅線者為陰性，出現(xiàn)2條紅線者為陽性；如無紅線出現(xiàn)，表明試紙條失效。早早孕試驗(yàn)陽性說明孕婦尿中含有絨毛膜促性腺激素（HCG）；陰性則說明尿中無HCG。

3.原理

斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（DICA）又稱一步金法，它以硝酸纖維膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使膜條測(cè)試端的待測(cè)尿液慢慢向另一端滲移，在移動(dòng)中，待測(cè)尿液內(nèi)的HCG（抗原）與膜上包被的金標(biāo)抗HCG結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，從而出現(xiàn)陽性反應(yīng)現(xiàn)象（實(shí)驗(yàn)圖4－4）

（四）ELISA雙抗體夾心法（示教）

1.原理以ELISA雙抗體法測(cè)乙肝病毒表面抗原（HBsAg）。用抗HBs包被反應(yīng)孔，加待測(cè)標(biāo)本，若其中有HBsAg，則與反應(yīng)板孔上的抗HBs結(jié)合，再加入酶標(biāo)抗HBs，加底物與色原顯色。顏色深淺與HBsAg含量成正比。（實(shí)驗(yàn)原理見教材免疫學(xué)應(yīng)用三、免疫診斷的圖4－6）。

2.實(shí)驗(yàn)步驟(1)包被：反應(yīng)板已經(jīng)包被已知抗體。(2)加樣：加一定濃度稀釋的待檢樣品(同時(shí)做空白對(duì)照，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照)0.1ml于上述已包被的反應(yīng)孔中，置濕盒中，37℃，1h。用洗滌緩沖液洗板6次，每次3min。(3)加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃，0.5～1h，用洗滌緩沖液洗板3次，每次3min。(4)加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的TMB底物溶液0.1ml，37℃，10-30min。(5)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.05ml。(6)結(jié)果：用肉眼觀察陽性對(duì)照血清顯色，陰性對(duì)照血清無色；被檢血清顯色為陽性，無色為陰性。

四、常用生物制品觀察（示教）生物制品是應(yīng)用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和液體等生物材料制備的，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。生物制品種類：用于預(yù)防的有活疫苗、死疫苗、聯(lián)合疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗、類毒素等；用于治療的有抗毒素、抗病毒血清、丙種球蛋白等；用于診斷的有診斷血清和診斷抗原。

【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】1.列表比較免疫器官的功能。2.繪圖吞噬細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象。3.分析豚鼠過敏性休克的結(jié)果。4.簡(jiǎn)述玻片凝集反應(yīng)的方法。5.判定試管凝集的效價(jià)，分析其結(jié)果。6.列出實(shí)驗(yàn)室陳列的生物制品的用途。

實(shí)驗(yàn)五病原微生物（示教）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握：常見的病原微生物的形態(tài)2.熟悉：常見細(xì)菌、真菌培養(yǎng)物的形態(tài)；抗鏈球菌溶血毒素“O”試驗(yàn)的臨床意義3.了解：厭氧培養(yǎng)法、血漿凝固酶試驗(yàn)、抗酸染色法的用途；肥達(dá)氏試驗(yàn)的臨床意義

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法】一、鏡下觀察病原微生物的形態(tài)二、觀察常見細(xì)菌、真菌培養(yǎng)物的形態(tài)特點(diǎn)三、血漿凝固酶試驗(yàn)四、抗酸染色法五、抗鏈球菌溶血毒素“O”試驗(yàn)六、肥達(dá)氏試驗(yàn)

一、鏡下觀察病原微生物的形態(tài)葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌、結(jié)核分支桿菌、白喉棒狀桿菌、炭疽芽胞桿菌、破傷風(fēng)梭菌、狂犬病毒包涵體、支原體、衣原體、立克次體、鉤端螺旋體、梅毒螺旋體、皮膚絲狀菌、白色念珠菌。

二、觀察常見細(xì)菌、真菌培養(yǎng)物的形態(tài)特點(diǎn) （一）細(xì)菌在血平皿培養(yǎng)物上的觀察

葡萄球菌（金葡、白葡）菌落的形態(tài)大小、色素、溶血環(huán)；鏈球菌（甲鏈、乙鏈）的菌落形態(tài)大小、溶血環(huán)。

（二）真菌培養(yǎng)物的觀察

真菌菌落在形態(tài)上可分三大類：1、酵母型菌落：外觀似白色葡萄球菌菌落，濕潤(rùn)柔軟、圓形、表面光滑。新型隱球菌等屬此型。2、類酵母型菌落：外形似酵母型菌落，不同之處是該型菌落生長(zhǎng)假菌絲伸入培養(yǎng)基內(nèi)。白色念珠菌屬此型。3、絲狀菌落：菌落表面似絨毛狀、粉末狀或棉花樣，一部分向空中生長(zhǎng)（稱空中菌絲），一部分菌絲伸入培養(yǎng)基內(nèi)（稱營養(yǎng)菌絲），且能產(chǎn)生各種色素。皮膚絲狀菌等屬這類菌落。

（三）厭氧培養(yǎng)法介紹 厭氧培養(yǎng)的方法很多，可分為生物法、物理法和化學(xué)法。下面只介紹生物法中的肉渣培養(yǎng)法。1．生物法----肉渣培養(yǎng)法 肉渣培養(yǎng)基的制作

成份：牛肉渣、牛肉浸液（牛肉膏）。

制法：將做牛肉浸液的牛肉渣，裝入試管，高約3毫米，加入牛肉浸液或牛肉膏湯（PH7．6）約5毫升，比肉渣高一倍。121℃高壓滅菌20-30min后保存于冰箱內(nèi)備用。

用途：用于厭氧菌培養(yǎng)。

注意：如無肉渣也可用牛、羊血等代替，將血塊先放入水內(nèi)煮沸，取出成小塊，血塊在加熱后搖勻成碎顆粒狀。

方法：以無菌操作方法，將檢查物接種于肉渣管內(nèi)。液面上加入已溶解的凡士林，高約0．5厘米，封閉液面，隔絕空氣，造成厭氧環(huán)境。37℃培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果。2．物理法----抽氣換氣法3．化學(xué)法----焦性沒食子酸法、硫乙醇酸鈉法、厭氧罐法、厭氧袋法等方法

三、血漿凝固酶試驗(yàn)

多數(shù)致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，此酶能使含有枸椽酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人血漿發(fā)生凝固。在一般情況下，非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生此酶。因此，是否產(chǎn)生凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)之一。

方法：1.用毛細(xì)吸管把已稀釋的兔血漿分別加入金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌的肉湯培養(yǎng)物中，每管加0.5毫升。2.輕輕搖動(dòng)試管，使之混勻。3.將試驗(yàn)管放入37℃水浴箱中，60min后觀察結(jié)果。凡血漿呈現(xiàn)凍膠樣凝固者，為血漿凝固酶陽性；若仍為液狀，則為陰性。

四、抗酸染色法

（一）方法1.取病人痰液涂片一張，在火焰外焰上固定。2.用長(zhǎng)木夾夾住標(biāo)本片的一端，然后加石炭酸復(fù)紅液數(shù)滴，使染色液覆蓋全部的痰液涂片處。將加了染色液的涂片置酒精燈火焰上方微微加溫，直到染液冒出蒸汽，維持5分鐘（切勿煮沸或煮干），若染液因加溫而減少則可適當(dāng)補(bǔ)充。（或加溫到染液冒出蒸汽即置臺(tái)上5分鐘亦可。）3.冷卻后，用自來水洗去多余的染料，此時(shí)標(biāo)本片呈紅色。4.用3%鹽酸酒精脫色，將3%鹽酸酒精滴加于涂片上，輕輕晃動(dòng)玻片，然后傾斜玻片，使酒精流盡，再次滴3%鹽酸酒精，晃動(dòng)玻片，直至無紅色顏料脫下為止，水沖洗。5.加堿性美藍(lán)液復(fù)染1分鐘，水洗，自干或用吸水紙吸干，油鏡檢查。

（二）結(jié)果抗酸性細(xì)菌（如結(jié)核桿菌）因不被鹽酸酒精脫色，呈紅色；非抗酸性細(xì)菌和細(xì)胞等因被鹽酸酒精脫色，則復(fù)染呈藍(lán)色。將觀察結(jié)果繪圖。

五、抗鏈球菌溶血毒素“O”試驗(yàn)

大多數(shù)對(duì)人類致病的A族溶血性鏈球菌都能產(chǎn)生溶血毒素“O”。溶血毒素“O”有溶解紅細(xì)胞、殺害白細(xì)胞及毒害心臟的作用。此外，溶血毒素“O”有抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，即抗鏈球菌溶血毒素O（ASO）。血清中ASO的測(cè)定可用于溶血性鏈球菌感染的診斷。ASO高滴度的病人血清被適量的溶血素中和后還有ASO多余，這些多余的抗體即與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。

（一）材料 1.溶血素“O”溶液，搖勻后使用 2.ASO膠乳試劑，搖勻后使用 3.陽性控制血清 4.陰性控制血清

（二）方法 定性檢測(cè)1.血清標(biāo)本用生理鹽水1:50稀釋，56℃滅活30min。2.在反應(yīng)板各方格上分別滴加稀釋滅活血清以及陽性和陰性控制血清一滴，再各滴加溶血素“O”溶液一滴。輕輕搖動(dòng)3分鐘，使其充分反應(yīng)，并均勻分布于方格內(nèi)。3.在各方格內(nèi)滴加ASO膠乳試劑一滴，于室溫為20℃的環(huán)境下輕輕搖動(dòng)8min，將反應(yīng)板平放在實(shí)驗(yàn)桌上，在自然光線下有清晰凝集者為陽性，不出現(xiàn)清晰凝集者為陰性。4.陽性的1:50稀釋血清，進(jìn)一步稀釋為1:80，再重復(fù)步驟2和3，有明顯凝集者為強(qiáng)陽性。

半定量檢測(cè)

1.待檢血清用生理鹽水倍比稀釋（方法如下表）：管號(hào)123稀釋倍數(shù)1:21:41:8生理鹽水100μl100μl100μl待檢血清100μl100μl100μl檢測(cè)標(biāo)本量50μl50μl50μl待檢血清中4008001600ASO的含量 2.取不同稀釋倍數(shù)的待檢血清各50μl進(jìn)行檢測(cè)（操作方法同定性檢測(cè)），陽性者即可從上表中查出待檢血清中ASO的含量。

（三）注意事項(xiàng)1.本試劑為定性的ASO膠乳，決非半定量試劑。在血清作適當(dāng)稀釋后，出現(xiàn)血清稀釋度和ASO滴度間的關(guān)系大致如下： 稀釋度 ASO滴度 1:50 ≥500 1:80 ≥800 1:100 ≥10002.ASO膠乳加入后，輕輕搖動(dòng)到本說明指定的時(shí)間，應(yīng)立刻記錄結(jié)果。放置一段時(shí)間后再出現(xiàn)的清晰凝集不列為陽性。陽性控制血清應(yīng)在本說明指定的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)清晰凝集。但不能將陽性控制血清出現(xiàn)凝集的時(shí)間為判斷結(jié)果的時(shí)間界限。3.溶血，脂血，高膽紅素血癥，高膽固醇血癥，類風(fēng)濕因子陽性都不會(huì)影響本試驗(yàn)結(jié)果。4.膠乳試劑不可冰凍，放置在4℃冰箱保存、有效期為一年，用前應(yīng)該搖勻。5.室溫降低10℃，在膠乳試劑加入后應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間2min，室溫升高10℃，應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間2min。6.本試驗(yàn)用的滴管口徑及裝膠乳試劑的塑料瓶的口徑應(yīng)同樣大小，保證滴液大小一致。

六、肥達(dá)氏試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)凝集反應(yīng)原理，用已知的傷寒桿菌鞭毛抗原（H）及菌體抗原（O）、甲型、乙型（肖氏）副傷寒桿菌鞭毛抗原（H）和病人血清作定量凝集試驗(yàn)，用于檢查傷寒、副傷寒抗體及其含量，作為診斷傷寒、副傷寒的參考依據(jù)。

（一）材料 1.病人血清 2.診斷菌液：傷寒桿菌“H”、“O”抗原 3.甲型、乙型（肖氏）副傷寒桿菌鞭毛抗原（H） 4.生理鹽水 5.試管、吸管、試管架、52℃水浴箱等

（二）方法 1.稀釋病人血清

（1）試管架上放置四排試管，每排6支，以吸管吸取生理鹽水，每管加入0.5ml。 （2）以1毫升吸管吸取病人血清（1:20），于每排的第一管各加入0.5毫升，然后混勻（吸吹各3次），使病人血清稀釋成1:40。 （3）按順序，進(jìn)行血清的一系列稀釋：即自每排的第一管吸取0.5ml（1:40）稀釋血清加入第2管中，充分混勻后，再自每排的第2管吸取0.5ml加入第3管，依此順序稀釋至第5管，混勻后，自每排的第5管吸出0.5ml棄去（放置盛有消毒液的缸內(nèi)）每排的第6管不加病人血清，以作對(duì)照。

2.加抗原

第一排，各管加傷寒“H”診斷菌液3滴； 第二排，各管加傷寒“O”診斷菌液3滴； 第三排，各管加副傷寒“甲”診斷菌液3滴； 第四排，各管加副傷寒“乙”診斷菌液3滴。 3.加完診斷菌液后充分搖勻，置52℃水浴箱中，約1:30h后或是37℃24h看結(jié)果。

4.觀察和記錄結(jié)果

（1）先觀察對(duì)照組：管內(nèi)液體均勻混濁。或久置后可見管底沉淀物呈圓形小團(tuán)，邊緣整齊，若輕輕搖動(dòng)試管，細(xì)菌則再分散于鹽水中而恢復(fù)均勻渾濁，即為不凝集。 （2）觀察試驗(yàn)管：第1～5管為試驗(yàn)管，如有凝集，管底出現(xiàn)凝塊并呈帽狀貼于管底，邊緣不整齊，液體澄清或較澄清。若輕輕搖動(dòng)試管，“H”凝集者凝塊呈棉絮狀懸于鹽水中，易散；“O”凝集者凝塊呈緊密的顆粒，不易散。 （3）以如下符號(hào)作記錄： ++++液體清亮，細(xì)菌完全被凝集于管底。 +++液體輕度混濁，細(xì)菌大部分被凝集于管底。 ++液體中等混濁，約有50%細(xì)菌被凝集于管底。 +液體很混濁，少量細(xì)菌凝集于管底。 －與對(duì)照管相同，液體混濁，管底無凝集，但有細(xì)菌沉淀的小圓團(tuán)。血清效價(jià)（滴度）：以呈現(xiàn)明顯凝集（++）的血清最高稀釋度表示。

5.報(bào)告方式

（1）報(bào)告O、H血清效價(jià)。 （2）血清最低稀釋倍數(shù)仍無凝集現(xiàn)象的報(bào)告陰性。 （3）如第6管的血清最高稀釋倍數(shù)時(shí)仍在++以上者，應(yīng)報(bào)告高于1：2560。 （4）正常值：傷寒“H”(TH)<1：160、傷寒“O”(TO)<1：80、甲型副傷寒(PA)<1：80、乙型副傷寒(PB)<1：80、丙型副傷寒(PC)<1：80。（5）臨床意義：輔助診斷傷寒、副傷寒。

【實(shí)驗(yàn)作業(yè)】 1.繪出下列微生物的鏡下形態(tài)葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌、結(jié)核分支桿菌、白喉棒狀桿菌、炭疽芽胞桿菌、破傷風(fēng)梭菌、狂犬病毒包涵體、支原體、衣原體、立克次體、鉤端螺旋體、梅毒螺旋體、皮膚絲狀菌、白色念珠菌。 2.簡(jiǎn)述抗酸染色的方法。 3.抗鏈球菌溶血毒素“O”試驗(yàn)有何意義？ 4.判斷肥達(dá)氏試驗(yàn)的效價(jià)，分析其結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)六醫(yī)學(xué)蠕蟲（示教）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握：常見醫(yī)學(xué)蠕蟲的成蟲和蟲卵的形態(tài)特征2.熟悉：蠕蟲中間宿主和感染階段；糞便寄生蟲卵檢查；肛門拭子法3.了解：蠕蟲其它結(jié)構(gòu)形態(tài)

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法】一、肉眼觀察蠕蟲成蟲大體標(biāo)本形態(tài)二、鏡下蟲卵形態(tài)觀察三、鏡下蠕蟲其它結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察四、蠕蟲中間宿主、感染階段的觀察五、糞便寄生蟲卵檢查六、肛門拭子法（示教）

一、肉眼觀察蠕蟲成蟲大體標(biāo)本形態(tài)

蛔蟲、鉤蟲、蟯蟲、鞭蟲、肝吸蟲、姜片蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲、日本血吸蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲。注意其前后端、雌雄、形態(tài)、顏色、大小、吸盤、睪丸特點(diǎn)、節(jié)片形態(tài)及注意線蟲、吸蟲及絳蟲之間的區(qū)別。

二.鏡下蟲卵形態(tài)觀察

蛔蟲卵（受精、未受精）、鉤蟲卵、鞭蟲卵、蟯蟲卵、肝吸蟲卵、姜片蟲卵、衛(wèi)氏并殖吸蟲卵、日本血吸蟲卵、帶絳蟲卵、鏈狀（豬）帶絳蟲、肥胖（牛）帶絳蟲頭節(jié)。注意蟲卵的大小、形態(tài)、顏色、卵殼及卵內(nèi)構(gòu)造。

三、鏡下蠕蟲其它結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

鉤蟲口囊（十二指腸鉤蟲、美洲鉤蟲）、蟯蟲食管球、（班氏、馬來）微絲蚴、旋毛蟲幼蟲囊包，注意囊包長(zhǎng)軸與肌肉纖維平行；日本血吸蟲毛蚴、尾蚴；鏈狀帶絳蟲、肥胖帶絳蟲頭節(jié)、孕節(jié)（子宮分支）

四、蠕蟲中間宿主、感染階段的觀察

肝吸蟲——豆螺、沼螺、淡水魚蝦、囊蚴；姜片蟲——扁卷螺、荸薺、菱角、茭白、囊蚴；肺吸蟲——川卷螺、溪蟹、蝲蛄、囊蚴；血吸蟲——釘螺、尾蚴；鏈狀帶絳蟲囊尾蚴（米豬肉）大體標(biāo)本

五、糞便寄生蟲卵檢查 （一）糞便直接涂片法（示教）

糞便檢查是診斷寄生蟲病常用的方法。要取得準(zhǔn)確的結(jié)果，糞便必須新鮮，送檢時(shí)間一般不宜超過24h。盛糞便的容器要干凈，并防止污染與干燥；糞便不可混雜尿液等，以免影響檢查結(jié)果。

方法：取清潔玻片1張，中央滴加生理鹽水1～2滴，用竹簽挑取少許新鮮糞便于生理鹽水中涂勻成薄膜，直徑約1cm，厚度以透過糞膜涂片剛可辨認(rèn)字跡為宜。先用低倍鏡觀察，必要時(shí)換高倍鏡檢查，但需加蓋玻片，以免污染鏡頭。

（二）飽和鹽水浮聚法（示教）

利用飽和鹽水的比重（1.17～1.18）大于某些蟲卵（主要是線蟲卵）比重的特點(diǎn)，使糞便中的蟲卵浮聚于飽和鹽水液面，可達(dá)到集卵的目的，提高檢出率。此法用于檢查鉤蟲卵效果最好，也可用于檢查其他線蟲卵和微小膜殼絳蟲卵。但不適用于檢查吸蟲卵和原蟲包囊。 方法：用竹簽取黃豆粒大小的糞便置于浮聚瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶）中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口，但不溢出為止。此時(shí)在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，鏡檢。 飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動(dòng)，直至食鹽不再溶解為止。

（三）沉淀法（示教）

利用蟲卵比重比水大的特點(diǎn)檢查蟲卵。有自然沉淀法、倒置沉淀法、離心沉淀法等，陽性率高。

六、肛門拭子法（示教）適用于在肛周產(chǎn)卵的蟯蟲，或常在肛門周圍帶絳蟲卵的檢查。現(xiàn)在常用透明膠紙法：用長(zhǎng)約6cm，寬約2cm的透明膠紙粘擦肛門周圍的皮膚，取下膠紙，將有膠面平貼玻片上，鏡檢。操作者應(yīng)當(dāng)在取材后立即消毒洗手，以防蟯蟲卵感染

【實(shí)驗(yàn)作業(yè)】1.繪出蛔蟲受精卵、蛔蟲未受