B43DB1302唐山市質量技術監督局發布DB1302/T249—2008本標準由唐山市質量技術監督局提出。本標準由遵化市畜牧水產局起草。本標準主要起草人：李愛民柳巖劉曉芳李曉光肖愛民聞聯國孝敬芝李莉任廣蓮。DB1302/T249—2008自然發情母牛冷凍胚胎移植技術規范本標準規定了細管冷凍胚胎移植中受體牛的選擇、排卵時間及移植時間確定、黃體質量判定、胚胎解凍技術、胚胎移植技術等。本標準適用于唐山地區奶牛一步法解凍細管冷凍胚胎對自然發情母牛移植。2受體牛選擇2.1健康狀況良好，無遺傳性和傳染性疾病。2.2體重在350kg以上，中等膘情。2.3青年牛連續正常發情三次以上。經產牛在三胎以內，產后連續正常發情兩次以上。2.4無難產、助產、胎衣不下史。2.5移植前60d內不得注射任何疫苗，不能使用激素類和驅蟲類藥物。3受體牛的發情鑒定3.1外部觀察鑒定3.1.1發情前期母牛不安、食欲減退、吼叫和爬跨其它母牛，外陰腫脹，流透明細長粘液，頻尿、擺尾，但不接受其它牛爬跨，經產牛產奶量下降。3.1.2發情中期外陰腫脹，粘膜潮紅，流透明粗長粘液，愿意接受其它牛爬跨，呆立。持續時間4h-6h。3.1.3發情后期流粗、短、混濁粘液，不接受其它牛爬跨，外陰腫脹開始消退，食欲及產奶量恢復正常。3.2直腸檢查鑒定子宮頸松軟，左側或右側卵巢有卵泡發育。3.3陰道檢查鑒定用陰道開張器插入陰道，借助光源，觀察陰道粘膜潮紅，子宮頸松弛，子宮頸口有多量透明粘液流4排卵時間確定4.1外部觀察發情結束后8h-12h排卵。4.2直腸檢查原卵泡發育部位變為凹陷或卵巢整體變形。4.3排卵時間約為1h-2h。5移植時間及部位確定5.1由排卵時間向后推7d即為移植時間。5.2移植部位為排卵側子宮角小彎處。6黃體質量判定6.1體積DB1302/T249—2008母牛排卵后7d的黃體直徑可以達到1cm-1.5cm，總體積占整個卵巢的1/2-1/3。6.2形狀正常黃體上端有一凹陷俗稱“火山口”，與卵巢實質部分界限明顯，部分突出于卵巢表面。6.3質感凹凸不平，呈“肉”樣感覺，光滑有彈性。7移植前準備7.1器械準備7.1.1移植槍、細管剪、大鑷子、器材盤全部用75%酒精消毒。7.1.2移植槍、細管剪酒精消毒自然揮發后再用火焰消毒。7.1.3移植槍火焰消毒后待溫度降至室溫時放入一次性軟外套內備用。7.1.4準備四層10cm2-15cm2無菌紗布一塊。7.2受體牛的準備7.2.1六柱欄保定7.2.2外陰部消毒a)肛門、尾根、外陰先用0.05%高錳酸鉀水沖洗。b)肛門、尾根、外陰再用溫開水沖洗。c)將外陰粘膜用75%酒精消毒。d)將外陰粘膜用75%酒精消毒后用0.9%生理鹽水沖洗干凈。7.3人員準備7.3.1需移植人員和助手各一人。7.3.2移植人員應穿好工作服，術前手臂消毒，剪短磨光指甲。8冷凍胚胎的解凍8.1解凍槽中放入35℃-38℃溫水。8.2由助手將放有胚胎細管的漏斗提至距液氮罐口5cm-10cm處。8.3用鑷子挾出所需的胚胎細管。8.4再由助手將放有胚胎細管的漏斗放回原位。8.5取出的胚胎細管在空氣中晃動5s-8s后用準備好的無菌紗布擦去細管表面的結霜，并迅速放入水中晃動20s-30s。8.6取出解凍好的胚胎細管再用無菌紗布擦去其表面殘存的水珠。8.7用左手捏住解凍好的胚胎細管棉塞端，使其另一端向上，右手拇指和食指配合輕輕彈動細管中上端，待細管內解凍液與保存液完全融合后即為解凍完畢。8.8核對胚胎細管外壁的標識內容。9胚胎細管裝入移植槍9.1裝入卡蘇式移植槍9.1.1將槍芯插入胚胎細管棉塞端1mm-2mm后將槍芯連同細管一起向后退，退至細管前端與槍前端差1mm-2cm位置。9.1.2用細管剪剪開細管前端。9.1.3套上一次性硬外套，使細管前端與硬外套前端金屬頭緊密結合。9.1.4套上軟外套。9.1.5槍頭向上輕輕推動槍芯使細管內的液體流至槍頭不能流出。9.2裝入節段式移植槍3DB1302/T249—20089.2.1將移植槍前段裝入軟外套中。9.2.2用細管剪剪開細管壓口端。9.2.3裝入移植槍前段使細管開口端與槍頭緊密結合。9.2.4槍芯插入細管棉塞端1mm-2mm。9.2.5推動移植槍后段（槍芯不動）與槍前段結合擰緊。9.2.6將整個移植槍裝入軟外套內。10移植操作10.1助手將牛尾拉向一側，露出肛門和陰門。10.2肛門部涂擦潤滑劑。10.3移植槍入陰道10.3.1用左手拇指和食指將受體牛陰門撥開。10.3.2右手將帶有軟外套的移植槍輕輕插入陰道深部。10.3.3再用左手輕拉軟外套，使移植槍前段由軟外套中拖出，至軟外套全部拉出陰道為止。10.4移植槍入子宮左手入直腸并掏出宿糞，握住子宮頸，左右手配合使槍過子宮頸并迅速達到黃體側子宮角小彎處。10.5移植10.5.1槍頭達到移植部位后迅速推動移植槍芯，將細管內容物連同胚胎一起推入子宮角內。10.5.2將胚胎推出后輕輕轉動移植槍1-2圈。10.5.3抽出移植槍。10.5.4將子宮角擺正到生理位置。10.5.5解除保定。如實填寫表1受體牛發情登記記錄表和表2受體牛移植情況記錄表。表1受體牛發情登記記錄表鎮（鄉）村年月日體重