第十二章遺傳病的診斷產(chǎn)前診斷1、甲胎蛋白AFP2、游離絨毛膜促性腺激素Free-HCGβ3、妊娠相關(guān)血漿蛋白PAPP-A2醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)六、基因診斷

(一)概念

基因診斷是指以DNA或者RNA為診斷材料，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢查基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能來診斷疾病的方法。3醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)（二）特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)

1.以探測基因?yàn)槟繕?biāo)，屬于“病因診斷”，針對(duì)性強(qiáng)?；蛟\斷的出現(xiàn)使人們對(duì)疾病的診斷模式由傳統(tǒng)的表型診斷過渡為現(xiàn)在的基因型診斷或稱逆向診斷。它和傳統(tǒng)的表型診斷方法的主要差異在于直接從基因型推斷表現(xiàn)型，即越過基因產(chǎn)物直接檢測基因結(jié)構(gòu)的改變（如單個(gè)堿基置換、缺失、插入、DNA的多態(tài)現(xiàn)象和遺傳病的遺傳異質(zhì)性等）。

4醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)

2.基因診斷取材來源廣泛?？梢允菣C(jī)體各種組織的有核細(xì)胞，因此基因診斷不受取材細(xì)胞類型和個(gè)體發(fā)育階段的限制，可以做出現(xiàn)癥病人的診斷及產(chǎn)前、發(fā)病前的早期診斷。

3.利用基因探針進(jìn)行檢測，靈敏度高、特異性強(qiáng)。5醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)

4.基因探針可以是任何來源、任何種類；其檢測目標(biāo)可以是一個(gè)特定基因或一種特定基因組合；可以是內(nèi)源基因或外源基因。因此，基因探針適用性強(qiáng)，診斷范圍廣。

5.被檢測的基因是否處于活化狀態(tài)對(duì)基因診斷并不重要，因此可對(duì)那些有組織和分化階段表達(dá)特異性的基因及其異常進(jìn)行檢測和診斷。

6醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)

此外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，從基因水平上診斷遺傳病的病種越來越多，操作上日趨簡單、方便、快速、準(zhǔn)確。所以基因診斷是診斷遺傳病最有前途的方法。7醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)原理用已知的核苷酸序列測定未知的核苷酸序列。主要包括分子雜交、DNA體外擴(kuò)增（PCR）、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)分析法等，其中最基本的技術(shù)是核酸分子雜交技術(shù)。8醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基因診斷的工具探針限制性內(nèi)切酶9醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基因診斷1、特異性寡核苷酸探針雜交2、Southern印跡雜交3、RFLP連鎖分析4、PCR10醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)1、等位基因特異性寡核苷酸探針雜交原理：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則鐮形細(xì)胞貧血的基因診斷已知突變基因編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子

GAG——GTG

谷Aa——纈Aa11醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)2.Southern印記雜交原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài),如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。12醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)

SouthernBlot操作步驟：DNA瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或顯色13醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)鐮形紅細(xì)胞貧血癥的分子診斷1.35Kb1.15KbＣＣＴＧＴＧＧＡＧ脯纈谷ＣＣＴＧＡＧＧＡＧ脯谷谷第１１號(hào)染色體ββＳMstII識(shí)別順序ββＳMstIIMstIICCTNAGG14醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)1.35Kb1.15Kb凝膠電泳圖HbAHbAHbAHbSHbSHbS15醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)3、RFLP連鎖分析DNA多態(tài)性：SNP、STRRFLP：不同個(gè)體的DNA用用一種限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，DNA片段長度會(huì)出現(xiàn)差異。16醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)已知限制酶MstII

識(shí)別序列MstII1.15kb

CCTGAGG1.35kbx

probeCCTGTGG突變后不能識(shí)別，酶切位點(diǎn)消失，限制酶切片段長度發(fā)生變化。17醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)限制酶切片段電泳后，SouthernBlot檢測，結(jié)果：

1.35kb1.15kb

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常鐮狀鐮狀貧血18醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)4、PCR聚合酶鏈反應(yīng)：在體外大量擴(kuò)增DNA或RNA分子的技術(shù)1983年，美國科學(xué)家穆里斯（Karl.Mullis）發(fā)明PCR技術(shù)，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)19醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)混合物將各種組分放到試管內(nèi)包括四種核苷酸，DNA聚合酶以及酶反應(yīng)時(shí)需要的離子，引物最后加入模板DNA，閉管20醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)步驟一：變性

利用高溫將DNA雙鏈分解成兩條單鏈21醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)步驟二：復(fù)性降低溫度使引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈模板上22醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)步驟三：延伸溫度升到DNA聚合酶最佳活性溫度，合成新的互補(bǔ)DNA鏈23醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)多次循環(huán)多次循環(huán)就可以大量復(fù)制模板DNA

24醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)最后得到巨量產(chǎn)物經(jīng)過幾十次的溫度循環(huán)，就能得到天文數(shù)字般多的復(fù)制產(chǎn)物25醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)三、分子診斷技術(shù)的應(yīng)用基因診斷在遺傳病中的應(yīng)用例如：鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷酶解正常人DNA和患者DNA，用標(biāo)記的

珠蛋白基因?yàn)樘结樧鱏outhern雜交26醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷限制性內(nèi)切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一種核苷酸），切割正常DNA產(chǎn)生1.1kb

珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA時(shí)，由于A

T破壞了MstⅡ的位點(diǎn)，便形成1.3kb

珠蛋白的DNA片段。27醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)例如：血友病A的基因診斷PCR技術(shù)與RFLP相結(jié)合的方法。首先用PCR技術(shù)將包含突變DNA的片段擴(kuò)增出來，然后用識(shí)別該位點(diǎn)的限制酶來酶解，電泳后直接檢測多態(tài)性位點(diǎn)的狀態(tài)。28醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基因診斷在腫瘤中的應(yīng)用ras基因突變的檢測

ras基因突變的檢測可采用PCR-ASO方法進(jìn)行，已知ras基因突變的熱點(diǎn)在12、13及61密碼子。

p53基因的檢測目前常用PCR法進(jìn)行檢測p53突變的熱點(diǎn)是外顯子5-8，一般可先選用外顯子5-8的引物進(jìn)行擴(kuò)增，其后再進(jìn)行突變位點(diǎn)的詳盡