DB51/T324大熊貓基因資源庫構建技術規程2025-03-19發布2025-04-19實施I前言 12規范性引用文件 13術語和定義 14基本要求 15大熊貓組織庫構建技術 26大熊貓精子庫構建技術 27大熊貓體細胞庫構建技術 3附錄A(資料性)大熊貓資源保存登記表 5附錄B(資料性)大熊貓精液與體細胞資源保存相關試劑配制 8本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由四川省林業和草原局提出、歸口、解釋并組織實施。本文件起草單位：成都大熊貓繁育研究基地。本文件主要起草人：侯蓉、劉玉良、安俊輝、王東輝、陳依嬌、陳佳松、蔡志剛、王海瑞、李媛。1DB51/T3245—僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本玻璃器皿使用前宜放入5%稀鹽酸中浸泡12h,再用手工或超聲波清洗器在加有洗滌劑的溫熱水中進行刷拭。洗凈的玻璃器皿用牛皮紙封口后進行高壓濕熱滅菌(120℃,20min),干燥后待用。使用之前進行高壓濕熱滅菌(120℃,20min),干燥后待用。槍頭高壓濕熱滅菌(120℃,20min),干燥后待用。毛巾及紗布清潔后進行高壓濕熱滅菌(120℃,20min),干燥后待用。膠塞、吸管膠頭、移液槍用75%酒精擦拭消毒，待酒精揮發盡后使用。2DB51/T3245—2025合GB/T42398的要求，宜為萬級以上的層流室，應配備超凈工作臺和紫外燈。紫外燈的強度為不少于1.5W/m3,紫外線燈管距地面不應超過2.5m,使用前照射20min~30min。大熊貓死亡后，盡快獲取其各類組織樣本，宜優先保存臟器組織(如心、肝、脾、肺、腎、卵巢、睪丸),用鑷子夾著組織在PBS、生理鹽水或無菌水中迅速漂洗樣本3次~5次，確保組織無明顯的血將組織用眼科剪或手術剪剪成0.2cm3~0.5cm3大小的組織塊，裝入2mL凍存管中(管壁應標注樣本主要信息)。樣本宜在-80℃超低溫冰箱或液氮中冷凍保存。填寫大熊貓組織資源保存登記表(參見表A.1)。清理大熊貓直腸內的糞便，對于位置較深而難以清理的糞便再用接近體溫的生理鹽水沖洗大熊貓的陰莖及包皮。電極棒加涂石蠟油后插入距直腸末端約1/3處并確保電極區抵住直腸上壁。調節電刺激采精儀，電壓2V~6V,一般采用1個~3個刺激系列，電刺激強度由低到高，每個刺激系列之間需間隔1min~5min,出現射精立刻停止刺激，將精液收集到集精杯6.2.1精液采集后，對采精量、pH值并填寫大熊貓精液資源保存登記表(參見表A.2)。6.2.2采精量：使用移液6.2.3pH值：使用精密pH試紙(測量區間為pH=6.4～9.7)測量精液的pH值。6.2.4精子密度：取5μL精液，添加995μL3%NaCl溶液，混合均勻后取10μL加入血球計數板(25×16型),在200×相差顯微鏡下計數。精子密度的計算公式為：密度=A×10?個/mL,其中：A為56.2.5精子活力：取5μL精液于載玻片上，加蓋蓋玻片后在37℃恒溫裝置的相差顯微鏡上，可采用目測評定法或計算機輔助分析系統分析法對精子活力進行評估。每個樣品至野中精子數≥200個)。直線前進運動的精子為100%者評為1.0級；90%者評定為0.9級；如此類推。6.2.6精子運動狀態：精子運動狀態評估與活力評估的操作相同，精子向前運動的狀態劃分為0級～5級，0指不運動，5級指快速向前運動。子(包括頭部畸形、頸部和中段畸形、主段畸形和過多的胞漿殘余體)的比率，每個樣品觀察精子總數≥200個。36.3.1稀釋：15mL離心管收集精液，稀釋液采用37℃水浴精液冷凍液(參見附錄B),根據精液密6.3.2平衡：15mL離心管收集稀釋后的精液，將離心管置于250mL燒杯(盛有200mL～220mL的37℃水)的中部，4℃冰箱中隔水緩慢降溫平衡4h。6.3.4冷凍：采用兩步法進行精液冷凍。第1步：將細管放置在冷凍架距離液氮面約7.5cm(溫度約為-110℃)處1min;第2步：用止血鉗將細管放置在冷凍架距離液氮面約2.5cm處1min(溫度約為-180℃),然后將細管放入液氮長期保存。6.3.5登記：對照大熊貓精液資源保存登記表(參見表A.2)進行準確填寫，對入庫細管的數量、冷按下列要求盡快采集樣本并填寫大熊貓體細胞資源保存登記表(參見表A.3),每只大熊貓個體至少保存1種細胞，宜來源于以下組織：——臍帶：大熊貓幼仔的臍帶組織，長度為不小于2cm;——肌肉：死亡大熊貓的肌肉組織，體積不小于2cm3;樣本均放置于4℃采樣液中，應及時運往實驗室。臍帶的運輸時間不宜超過24h,皮膚的運輸時間不宜超過48h,肌肉的運輸時間組織不宜超過7d。7.2.1臍帶來源細胞：將收集的臍帶樣本清洗干凈，盡可能剪碎一些，37℃下先后用1mg/mLIV型膠原酶與0.25%胰蛋白酶進行消化10min～15min,800×g離心5min收集細胞。7.2.2皮膚來源細胞：將皮膚組織樣本用眼科剪剪碎，37℃下先用1mg/mLI型膠原酶消化30min~45min,再用0.25%胰蛋白酶消化20min~30min,800×g離心5min收集細胞。7.2.3肌肉來源細胞：將肌肉組織樣本用眼科剪剪碎，37℃下先用2mg/mLI型膠原酶消化30min~45min,再用0.25%胰蛋白酶消化20min~30min,800×g離心5min收集細胞。對于分離的細胞加入對應的培養基(見附錄B)重懸后接種于培養皿，放置于37℃、5%CO?的培養箱中培養，記為原代細胞(PO)。當細胞匯合度達到70%～90%時，進行細胞傳代：棄去培養基，用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化2min~5min后終止消化，800×g離心5min收集細胞并使用對應培養基培養，記為P1。P1細胞匯合度達70%～90%時再次傳代，此時記為P2,依次類推。7.4.1細胞計數與活率檢測：細胞消化、離心后7.4.2微生物檢測：入庫細胞要求無細菌、真菌、支原體污染，檢測技術按照GB/T40365執行。DB51/T3245—4將待冷凍的細胞轉入梯度降溫盒中，-80℃冰箱過夜后轉入液氮進行長期保存。凍存管在使用前需對大熊貓譜系號、細胞類型及凍存日期進行標注。對于每個樣本需要至少保存于90%。7.4.4入庫登記：填寫大熊貓體細胞資源保存登記表(參見表A.3),登記表與凍存管的信息應保持本標準涉及樣品的液氮保存，液氮生物容器的安全管理按照GB/T5458執行。5(資料性)表A.1至表A.3給出了大熊貓組織、精液及體細胞資源保存登記表。(呼名/譜系號-組織類型-X)呼名譜系號(XX歲)死亡時間(年/月/日/時)采樣時間(年/月/日/時)原因組織類型(心/肝/脾/肺/腎/等)/格子號(年/月/DB51/T3245—20256個體信息備注呼名譜系號采樣時間(年/月/日/時)(XX歲)(個活力畸形率(呼名/譜系號-精液-X)(支)置(罐/提(年/月/日/時)7DB51/T3245—個體信息組織采樣信息呼名譜系號采樣時間(年/月/日/時)組織類型(臍帶、皮膚、肌肉等)間(小時)次率(個/管)量(管)(罐/提/架/格子號)(年/月/日/時)DB51/T3245—20258(資料性)表B.1給出了精液冷凍液的配方。甘油青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(100×)總體積容量瓶定容至100mL。所需試劑占比應為：蔗糖所占比例為12%,卵黃20%,甘油5%,青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺溶液1%(青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺溶液含有10,000單位/mL青霉素、10,000μg/mL鏈霉素和29谷氨酰胺)。按比例將冷凍液與鮮精混合稀釋，使冷凍精液中的甘油終濃度為3.33%。真菌-抗生素(100×)總體積表B.3給出了臍帶來源細胞培養基的配方。試劑青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(100×)總體積DB51/T3245—9表B.4給出了皮膚來源細胞培養基的配