第十二章

植物細(xì)胞工程與作物育種

植物細(xì)胞工程（plantcellengineering）是以植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一門學(xué)科。它以細(xì)胞為基本單位，在體外（invitro）條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿生產(chǎn)某種物質(zhì)的過程。ControlofinvitrocultureCytokininAuxinLeafstripAdventitiousShootRootCallus

體細(xì)胞克隆變異somaclonalvariation）指植物組織和體細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異。第一節(jié)

細(xì)胞和組織培養(yǎng)與作物育種1.體細(xì)胞克隆變異及其育種利用

1.1體細(xì)胞克隆變異的遺傳基礎(chǔ)

1）染色體數(shù)目變異

最多見的是多倍體，主要是培養(yǎng)基中使用了細(xì)胞分裂素引起。

二倍體變異的頻率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低，四倍體變異的頻率卻隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加。

2）染色體結(jié)構(gòu)變異

染色體結(jié)構(gòu)變異是體細(xì)胞克隆變異的主要來源，最重要的是染色體缺失、倒位、重復(fù)和異位。很多體細(xì)胞再生株減數(shù)分裂時(shí)形成多價(jià)體、染色體橋、小片段、環(huán)等，充分說明了染色體結(jié)構(gòu)變異的存在。

3）點(diǎn)突變

自發(fā)突變，很多通過細(xì)胞篩選獲得的抗病、抗除草劑等突變體屬于此類。

誘發(fā)突變，培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑或進(jìn)行誘變處理。

轉(zhuǎn)座因子是造成體細(xì)胞突變的原因之一，轉(zhuǎn)座子通過插入與解離使某些基因的表達(dá)受到調(diào)控。

Tos17

Miyoetal,2012,PlantCellPhysiol.4）轉(zhuǎn)座因子（5）表觀遺傳學(xué)修飾

各種類型的突變體:

抗性突變體:抗病、耐鹽、抗重金屬;

形態(tài)性狀突變體:矮化性、葉型;

不育性:核基因的突變;

產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的改變等。1.2突變體的篩選

將外植體、愈傷或懸浮系用誘變劑處理(如使用化學(xué)誘變劑，要充分洗滌后再進(jìn)入下一步的工作)。劑量和處理時(shí)間應(yīng)根據(jù)具體試驗(yàn)確定。

在突變體篩選中常采用一步篩選法和多步篩選法。

一步篩選法是將培養(yǎng)物接種在含有最低全部致死劑量的培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出生長的培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移到含有抑制劑的新鮮培養(yǎng)基上。多步篩選法

首先使用半致死劑量對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，每次繼代將上代能生長的細(xì)胞系繼代到篩選劑濃度提高的新鮮培養(yǎng)基上。

在這種篩選體制下，抗性細(xì)胞應(yīng)該比野生細(xì)胞長的快，通過逐步增加篩選劑水平，最終會(huì)篩選出在抑制劑超過最低全部致死濃度時(shí)也能旺盛生長的細(xì)胞系。

篩選的材料對(duì)象可以是原生質(zhì)體、愈傷塊、懸浮培養(yǎng)物和花粉/小孢子培養(yǎng)物。

利用原生質(zhì)體進(jìn)行抗性篩選出的克隆極有可能來自單細(xì)胞，但操作困難。

利用愈傷塊篩選最簡單，但愈傷塊里的個(gè)細(xì)胞不能均等地接觸抑制劑，篩選結(jié)果bu可靠。

懸浮細(xì)胞篩選細(xì)胞接觸選擇劑較均勻，但存在一定的操作復(fù)雜性。

花粉/小孢子培養(yǎng)物用于突變體篩選突變體很容易表現(xiàn)出來，也很易純合。

優(yōu)良品種

↓

細(xì)胞培養(yǎng)

R0

↓

R1群體

↓

改良的體細(xì)胞克隆

確定遺傳方式

↓

田間實(shí)驗(yàn)

遺傳穩(wěn)定性測試

↓

多點(diǎn)田間實(shí)驗(yàn)

育成新品系

↓

繼續(xù)田間實(shí)驗(yàn)，種子富集

區(qū)域試驗(yàn)

↓

審

定

↓

投入生產(chǎn)

圖

利用體細(xì)胞克隆變異育種的技術(shù)路線1.3作物改良上的應(yīng)用Chenetal,AnEfficientRiceMutagenesisSystemBasedonSuspension-CulturedCells.2013,JIPB2.1單倍體細(xì)胞培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)（antherculture）是指在獲得單倍體的一種技術(shù)。

antherculture–easiestandsimplest

pollen(microspore)culture–advantages

-lesscompetitionamongmicrospores

-nodiploidantherwalls

-greaterpotentialhaploidplantproduction2

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種利用Anther/MicrosporeCulture（1）后代的快速純合

在異花授粉作物中，可用單倍體產(chǎn)生加倍單倍體（DH系），從中篩選純合自交系用于雜交制種。

（2）提高選擇效率

如某一性狀受一對(duì)基因控制，F(xiàn)1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中AA個(gè)體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍。2.2單倍體育種的優(yōu)點(diǎn)（3）排除雜種優(yōu)勢對(duì)后代選擇的干擾

采用DH群體進(jìn)行選擇育種，各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能代表真實(shí)變異。

（4）遺傳研究的良好材料體系

單倍體是基因互作檢測、遺傳變異估計(jì)、連鎖群構(gòu)建、QTL估計(jì)及定位等數(shù)量遺傳學(xué)的良好材料。2.2.單倍體育種的優(yōu)點(diǎn)

（5）突變體的篩選

由于單倍體的各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，從而大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率。2.2單倍體育種的優(yōu)點(diǎn)小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體小孢子，然后經(jīng)單核早期、單核靠邊期、雙核期（一個(gè)營養(yǎng)核和一個(gè)生殖核），最后到達(dá)三核期而成為成熟花粉粒。在離體培養(yǎng)條件下，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制。Bajaj,Y.P.S.1983.InD.A.Evans,W.R.Sharp,P.V.Ammirato,andY.Yamada(eds.),HandbookofPlantCellCulture.Volume1.TechniquesforPropagationandBreeding.MacMillan,NewYork.p.228-287.2.3離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育

Similarnuclei3to5°CMicrosporeEmbryo3to5°CGenerativeVegetative（4）花蕾和花藥的預(yù)處理對(duì)于有些物種，培養(yǎng)前對(duì)花藥和花蕾進(jìn)行預(yù)處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。TobaccoDaysin

Culture5°Cfor72hControl003712510%Pollenw/identicalnuclei2.4影響花藥培養(yǎng)的因素

1）供體植株的生長條件

供體植株的生長條件對(duì)培養(yǎng)效果有重要影響。

2

）供體植株的年齡

供體植株對(duì)培養(yǎng)效果也有一定影響.

3）花粉發(fā)育時(shí)期

用于培養(yǎng)的花蕾，其花藥內(nèi)小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)培養(yǎng)效果有較大影響，但因物種而異。

（5）培養(yǎng)基多數(shù)情況下，MS、N6及馬鈴薯提取液培養(yǎng)基在禾谷類作物中用的較多。

(6）培養(yǎng)條件

多數(shù)植物在25℃下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可某些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫35℃下處理幾天，然后進(jìn)入25℃培養(yǎng)能收到最好效果。花藥培養(yǎng)一般在暗處進(jìn)行，直到愈傷或胚狀體形成再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。2.5花粉（小孢子）培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)是以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)在于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體。2.6單倍體誘導(dǎo)中存在的問題

1)能形成有活力胚的花藥百分率很低;

2)導(dǎo)致胚敗育;

3)在產(chǎn)生單倍體的同時(shí)產(chǎn)生二倍體或四倍體；

4)培養(yǎng)中小孢子he二倍體組織分裂；

5)白化苗難以避免；

6)在混倍性的材料中很難分離出單倍體;2.7單倍體細(xì)胞培養(yǎng)與植物育種

單倍體是高度不育的，需要進(jìn)行加倍處理才能應(yīng)用。秋水仙素是常用的染色體加倍藥劑，可以用1%的秋水仙素對(duì)正處于對(duì)數(shù)生長期的懸浮細(xì)胞進(jìn)行處理，一般24h左右。也可在固體培養(yǎng)基中加適當(dāng)濃度的秋水仙素。A品種

×B品種

↓

F1雜交種

↓小孢子培養(yǎng)或花藥培養(yǎng)

單倍體培養(yǎng)

↓染色體加倍

重組純合系

↓選擇

重組了A和B品種優(yōu)點(diǎn)的純系

↓自交、田間測試

遺傳穩(wěn)定性測試

↓田間測試

新品系→→→→→確定遺傳基礎(chǔ)

↓品種親本

↓

-------------------------------雜交

推廣利用↓雜種優(yōu)勢利用

圖單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種技術(shù)AntherandmicrosporecultureUsesinplantbreedinggroup1(asparagus,maize,rubber)DHsproducedwithlowefficiencygoals-asparagusallmaleF1hybridsmaizeDHsarescreenedlikeotherinbredsgroup2(wheat,melons,peppers)rel.largeno.ofDHscanbeproducedgoals–geneticmaps;separating&IDingdiseaseresistancegenes(e.g.,CMVresistanceinpepper)AntherandmicrosporecultureUsesinplantbreedinggroup3(rapeseed,barley,rice)–DHlineseasyrice–linesusedtodevelopvarieties,esp.japonicasubspeciesrapeseed–pedigreeselectionprogramsandparentallinesforF1hybridvarietiesbarley–winterbarleyvarietiesusemicrosporeculture,springbarleyvarietiesusethebulbosummethod(tobediscussedlater)

植物胚胎培養(yǎng)（embryoculture）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在離體無菌培養(yǎng)條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。植物幼胚和胚珠培養(yǎng)是植物遠(yuǎn)緣雜交育種的重要輔助手段。3幼胚培養(yǎng)與遠(yuǎn)緣雜交育種1)需要較少的空間就能保存大量的無性系;

2)保存過程中可避免病蟲害的侵襲;

3)長期保存;

4)保存多種類型材料,愈傷組織、莖尖、幼胚、花粉形成的單倍體愈傷組織等。4.種質(zhì)的長期保存4.1.優(yōu)點(diǎn)緩慢生長保存法和超低溫保存法。

緩慢生長法包括降低培養(yǎng)溫度、減少氧氣含量、將組培材料脫水干燥等。

超低溫保存法是在超低溫情況下，使生物的代謝和衰老過程大大減慢甚至完全停止。4.2保存的方法

超低溫通常指低于-80℃的低溫，保存介質(zhì)或容器有干冰（-79℃）、超低溫冰箱（-80—150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽相（-140℃）等，其中液氮最常用。

病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，頂端分生組織一般不帶毒，植物莖尖脫毒在無性繁殖(如馬鈴薯、甘薯、果樹、多年生花卉等)作物的提純復(fù)壯中有很重要的應(yīng)用價(jià)值。

大多數(shù)果樹和觀賞植物是高度雜合的，它們的種子后代無法與原品種相同，如要保持原種特性，需利用莖尖培養(yǎng)快速繁殖。5脫毒及繁殖重要品種或材料

植物材料的快速繁殖主要是通過誘導(dǎo)莖芽形成實(shí)現(xiàn)的，通過兩種途徑使莖芽增殖:一種是通過愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽形成，然后分株培養(yǎng)，便可獲得大量遺傳上基本一致的無性系。另一種是誘導(dǎo)莖尖或不定芽萌發(fā)或形成叢生芽也可達(dá)到快速繁殖的目的。InvitrosomaticembryogenesisofEuphorbiapulcherrimaSomaticembryogenesisinRosahybridacv.Landora

人工種子（artificialseeds）是指將細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或其類似物，經(jīng)過有機(jī)化合物的包埋而形成的能在適宜條件發(fā)芽的類似于天然植物種子的顆粒體。在固定雜種優(yōu)勢、快速繁殖良種和不育材料、節(jié)約用種、工廠化生產(chǎn)種子方面都有潛在價(jià)值。它通常由三部分組成：體細(xì)胞胚、人工胚乳、人工種皮。6人工種子的生產(chǎn)植物原生質(zhì)體（protoplast）是一個(gè)沒有壁的細(xì)胞，原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)變得很脆弱，很容易破裂,使得原生質(zhì)體的操作難度較大，可一旦再生了壁就恢復(fù)了細(xì)胞的全能性，具有了同正常細(xì)胞一樣的特性。第2節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交

原生質(zhì)體分離的基本原則是保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害它的再生能力，其先決條件是要有一個(gè)合適的滲透壓。1原生質(zhì)體的分離1.1分離方法

分離原生質(zhì)體的方法一般有機(jī)械分離和酶法分離兩種。

機(jī)械法分離先對(duì)材料進(jìn)行質(zhì)壁分離處理，然后切割釋放出少量的不受損傷的原生質(zhì)體。用這一方法僅能從液泡很大的材料中獲得原生質(zhì)體，而不能應(yīng)用于分生細(xì)胞。酶法分離原生質(zhì)體是目前常用的方法，可分為一步法和二步法。

一步法是將果膠酶（pectinase）和纖維素酶（celluluse）等混合處理材料，直接分離獲得原生質(zhì)體。

二步法是先用果膠酶處理材料，降解細(xì)胞間層使細(xì)胞分離，再用纖維素酶水解胞壁釋放原生質(zhì)體。ProtoplastsIsolationandCulture1.2影響原生質(zhì)體分離的因素

1）材料來源

葉肉細(xì)胞是常用的材料，因?yàn)槿~片很容易獲得而且遺傳上較一致，其次為愈傷細(xì)胞或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。

2）滲透壓原生質(zhì)體分離之前必須確定一個(gè)適合的滲透壓。在這種滲透壓下，原生質(zhì)體的分離、純化過程中都不致使原生質(zhì)體受損傷。3）酶植物細(xì)胞壁是一個(gè)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，由纖維素和半纖維素組成，需要一定的酶組成才能降解它。廣泛使用的商品酶制劑可以從很多公司購買。4）分離培養(yǎng)基

Ca2+對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和穩(wěn)定性有很大影響，它是細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)能穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)。另外，Mg2+、PO43-對(duì)于原生質(zhì)體活力的保持也有重要作用，所以分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)基中除酶外，一般含這些離子。5）培養(yǎng)條件酶處理時(shí)的溫度和pH最重要。PH使用范圍為4.8-7.2，可是，高pH（大于6.0）一般有利于原生質(zhì)體的生存，可能是高pH降低了細(xì)胞壁降解時(shí)產(chǎn)生的有害酶活性和存在于分離培養(yǎng)基中的毒性物質(zhì)的活性。為了防止pH的變化，常加入MES[2（N-morpholino）-ethanesulfonicacid]。這是一種緩沖劑，一般使用量為3mM。6）組織前處理高滲前處理、激素處理、低溫處理、激素與低溫結(jié)合前處理等對(duì)不同植物原生質(zhì)體分離可能有較好的效果。

1.3原生質(zhì)體的收集、純化和活力測定

原生質(zhì)體酶解完成后，將其用200目篩過濾，濾液再用400目過濾，收集濾液，低速離心，去上清液。用含有酶解液同樣滲透劑的無酶CPW液將原生質(zhì)體懸起，再離心，去上清，反復(fù)幾次，便完成原生質(zhì)體的洗滌工作。

原生質(zhì)體的純化可采用蔗糖懸浮法、梯度離心法或二相界面法，具體操作方法可參考專業(yè)書籍。用Evan’sblue或FDA測定原生質(zhì)體活力，以確定原生質(zhì)體的分離效果。平板培養(yǎng)

液體淺層培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)

液-固雙層培養(yǎng)

瓊脂糖包埋

看護(hù)培養(yǎng)2原生質(zhì)體培養(yǎng)2.1.培養(yǎng)方法1)原生質(zhì)體培養(yǎng)一般在暗處進(jìn)行，有利于壁形成和細(xì)胞再生。

2)原生質(zhì)體培養(yǎng)一般在22-25℃進(jìn)行，高、低溫都有害。

3)培養(yǎng)基無機(jī)營養(yǎng)和有機(jī)營養(yǎng)組成都對(duì)培養(yǎng)效果有顯著影響。

4)選擇適當(dāng)?shù)臐B透壓對(duì)于獲得大量原生質(zhì)體并保持其活力均很重要，一般用甘露醇或山梨醇調(diào)節(jié)滲透壓。

5)生長素對(duì)于培養(yǎng)早期壁的形成是需要的，最常用的是2，4-D，有時(shí)需要生長素與分裂素結(jié)合使用。2.2.培養(yǎng)條件3細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交）

原生質(zhì)體融合技術(shù)是實(shí)現(xiàn)基因重組的一條途徑，目前利用細(xì)胞融合已從很多作物種、屬間，甚至科間獲得雜種體細(xì)胞雜種，創(chuàng)造了一些自然界不存在的植物類型，有效地拓寬了植物育種的資源。UsesforProtoplastFusionCombinetwocompletegenomesAnotherwaytocreateallopolyploidsPartialgenometransferExchangesingleorfewtraitsbetweenspeciesMayormaynotrequireionizingradiationGeneticengineeringMicro-injection,electroporation,AgrobacteriumTransferoforganellesUniquetoprotoplastfusionThetransferofmitochondriaand/orchloroplastsbetweenspecies1）NaNO3處理誘發(fā)融合

由NaNO3誘導(dǎo)的可重復(fù)、控制的離體原生質(zhì)體融合。這種融合的機(jī)制一般認(rèn)為是Na+造成了膜電位的改變。3.1融合方法

分離的原生質(zhì)體不帶電荷，它們相互排斥，所以一般要在誘發(fā)條件下才能發(fā)生融合。

2）高pH—高濃度鈣離子處理

煙草葉肉原生質(zhì)體在高Ca2+（0.05MCaCl2）和高pH（10.5）條件下能很快誘發(fā)融合（37℃），但融合頻率不很高，高pH也影響原生質(zhì)體的存活率，且易誘發(fā)多個(gè)原生質(zhì)體融合。高Ca2+高pH誘發(fā)融合的機(jī)制是改變了膜位及膜的物理結(jié)構(gòu)。

3）PEG（聚乙二醇）處理

PEG誘導(dǎo)不僅融合頻率高，而且使二核融合頻率增加且無特異性。影響原生質(zhì)體聚集及隨后融合的因子很多，如PEG的分子量及濃度、原生質(zhì)體的材料來源、分離原生質(zhì)體時(shí)使用的酶制劑、離子種類和濃度、融合溫度等。

4）電融合

當(dāng)兩個(gè)原生質(zhì)體處于接觸狀態(tài)時(shí)，給一個(gè)5—12μamp的電流持續(xù)1—5s，原生質(zhì)體首先受刺激，然后馬上融合。應(yīng)用電融合時(shí)，原生質(zhì)體輕微收縮，表明其膜狀態(tài)有一個(gè)短暫的變化。電融合包括兩個(gè)步驟：

①電泳：在電極的作用下，原生質(zhì)體泳到一起，建立一個(gè)膜接觸狀態(tài)，形成念珠鏈。

②融合：由于膜的可逆性電激穿，使原生質(zhì)體發(fā)生融合。3.2、融合方式

原生質(zhì)體融合有兩種融合方式，即對(duì)稱融合和非對(duì)稱融合。這兩種融合方式都能產(chǎn)生三種類型的雜種：綜合了雙親全部遺傳物質(zhì)的對(duì)稱雜種；部分遺傳物質(zhì)發(fā)生丟失的非對(duì)稱雜種；只具有融合雙親一方核遺傳物質(zhì)的胞質(zhì)雜種。

對(duì)稱融合即雙親的核質(zhì)組裝在一起的融合。

非對(duì)稱融合指在融合前對(duì)一方親本原生質(zhì)體施加一定的處理，純化其細(xì)胞質(zhì)，再和另一方原生質(zhì)體融合，從而得到非對(duì)稱雜種或胞質(zhì)雜種。

對(duì)供體進(jìn)行處理的方法有多種：射線（X、γ和紫外線）輻射原生質(zhì)體；限制性內(nèi)切酶處理原生質(zhì)體；紡錘體毒素、染色體濃縮劑處理原生質(zhì)體，其中射線的作用最好。

1）形態(tài)互補(bǔ)利用兩種原生質(zhì)體形態(tài)色澤上的差異，在融合處理后，分別接種在帶有小格的培養(yǎng)皿中，每個(gè)小格中約有2—