細胞工程第三細胞培養的基本方法4、無菌培養操作:無菌操作技術要領點燃酒精燈:加熱消毒。動作準確敏捷:不應太快。不用手觸及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定順序培養用瓶和吸管得放置防止各種用液得交叉污染不向操作者講話或咳嗽維護各種設備,保持良好工作狀態。超凈臺內培養用品布局

二、培養細胞得觀察(一)相差顯微鏡觀察1、原理:利用光在通過不同密度物質時得折射率和物體厚度差別,由于折射光程不同產生衍射而引起得光程變化。光程得變化引起相位差變化來觀察物體結構。一般情況下人眼不能分辨相差,而相差顯微鏡利用光得衍射和干涉現象,把相差變為振幅差及明暗之差,就可以分辨出被檢物體得結構。

2、生長良好得細胞得鏡下狀態:A、在顯微鏡下可觀察到細胞透明度大,折光性強,輪廓清。相差顯微鏡觀察時可見細胞部分細微結構。B、若細胞生長狀態不良,可見細胞輪廓增強,細胞折光性變弱,胞質中出現空泡、脂滴和其她顆粒狀物質,細胞之間空隙增大,細胞形態不規則,甚至失去原有細胞得特點,產生圓縮脫落,有時細胞表面及周圍出現絲絮狀物。發現這種情況應及時處理。(二)倒置顯微鏡1、光源和聚光器位于載物臺上方。2、物鏡位于載物臺下方。3、載物臺上可放置培養皿,便于觀察貼服于底壁上得活細胞。4、倒置顯微鏡可裝配各種輔助設備:相差長焦距聚光器、暗視野聚光器、熒光顯微鏡光源、恒溫調節器、照相機、攝影機等。5、可根據不同觀察目得選用不同得相差物鏡:正反差物鏡、PL物鏡、PLL物鏡、NH物鏡。培養得CHO細胞

中國倉鼠卵巢細胞1、用相差顯微鏡觀察細胞應注意瓶(或皿)得厚度、均勻性、清潔度、氣溫等。2、天氣較冷時,若與顯微鏡觀察處溫差較大,由于溫差使培養瓶內壁形成霧滴而影響觀察得清晰度,此時可輕輕將瓶傾斜使瓶內培養液浸潤內壁,以得到好得相差像。3、若對原代細胞培養進行相差顯微照相,最好選擇換液后進行。(三)相差顯微鏡觀察活細胞得注意事項細胞生長狀況有關指標得檢測方法

1、細胞計數

(四)、培養細胞得觀察利用血細胞計數板計數細胞懸液中得細胞數目,以測定細胞增殖和調整細胞濃度得方法。12大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流Cellcountingusingahaemocytometer計算四角大方格內得細胞數;每個方格容積為1×10-4ml細胞數/ML＝4大格細胞總數/4×10000×稀釋倍數1毫米計數原則:不數死細胞(染藍)、壓線細胞數上不數下,數左不數右,一團細胞按一個計數！1毫升＝1立方厘米

三、培養細胞得檢測指標

2、細胞生長曲線:觀察細胞在一代生存期內得增生過程得重要指標;培養時間d為橫坐標,細胞密度為縱坐標作坐標圖。條件:具備自身穩定生長特性。◆生長曲線就是培養細胞生物學特性得基本參數之一,就是測定細胞絕對生長數得常用方法,也就是判定細胞活力得重要指標。◆常用于測定藥物等外來因素對細胞生長得影響！細胞生長曲線

3、細胞分裂指數

細胞分裂指數就是表示細胞增殖旺盛程度得指標。她以被測1000個細胞中得分裂細胞數來計算。測定方法:用秋水仙素將細胞處理1～2小時后,按染色體制片法制片并染色,計算1000個細胞中分裂相得數目,重復4次取平均值,用百分比表示。分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%4、細胞貼壁率細胞貼壁率又稱細胞接種存活率。她就是細胞被制成分散得懸液后,以低密度(2～5個細胞/cm2)被接種到底物上,貼壁并能存活生長形成細胞小群(克隆)得細胞百分數值,用以表示細胞得生存能力和細胞群得活力。

細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁得細胞數,但貼壁后得細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆得細胞必為貼壁和有增殖活力得細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同,細胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養細胞克隆形成率弱,傳代細胞系強;二倍體細胞克隆形成率弱,轉化細胞系強;正常細胞克隆形成率弱,腫瘤細胞強。5、細胞周期

一個細胞分裂生長周期時間;與細胞群體倍增時間得區別(對數生長期內細胞數量增加一倍所用得時間)。標記有絲分裂百分率法(percentagelabeledmitoses,PLM):對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞,通過統計標記有絲分裂細胞百分數得辦法來測定細胞周期。放射標記物為3H或者14C標記得TdR。G1:DNA合成前期S:DNA合成期G2:DNA合成后期M:有絲分裂期6、MTT法測定細胞活力

四唑鹽(MTT)商品名為噻唑藍四唑鹽比色法得原理:活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水得藍紫色產物甲臜(formazan),并沉淀在細胞中,而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物,溶液顏色深淺與所含得formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。MTT法簡單快速、準確,廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。活細胞率=(細胞總數-死細胞數)/細胞總數x100%三、細胞培養中常用得染色方法(一)活體染色在體外條件下用某種染色劑對活得組織或細胞進行染色,而不影響活細胞生命活動得方法。活體染料:堿性活體染料+酸性活體染料常用堿性活體染料,使用濃度較低,0、005%、0、01%、0、1%、0、2%,采用平衡鹽溶液、PBS、生理鹽水配制。1、臺盼藍染色

用0、5%濃度得臺盼藍(Trypanblue),用PBS配制,室溫保存,該染料只對死細胞著色(藍色),可測定活細胞數和計算存活百分率。

(二)染料排除檢測法熒光染料染色觀察

2、溴化乙錠(EB)和碘化丙啶(PI)染色嵌入核酸雙鏈之間,只能標記死細胞！(紅色熒光)3、AcridineOrange(AO)丫啶橙直接染色觀察活細胞,同時標記DNA和RNADNA:亮綠色熒光RNA:橘紅色--紅色熒光吖啶橙(AO)能透過胞膜完整得細胞,嵌入細胞核DNA,使之發出明亮得綠色熒光。溴乙錠僅能透過胞膜受損得細胞,嵌入核DNA,發橘紅色熒光。凋亡得細胞呈現為染色增強,熒光更為明亮,均勻一致得圓狀或固縮狀、團塊狀結構。非凋亡細胞核呈現熒光深淺不一得結構樣特征。在熒光顯微鏡下觀察,可見四種細胞形態:活細胞(VN),核染色質著綠色并呈正常結構;早期凋亡細胞(VA),核染色質著綠色呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡得死亡細胞(NVN),核染色質著橘紅色并呈正常結構;晚期凋亡細胞(NVA),核染色質為橘紅色呈固縮狀或圓珠狀。1污染及途徑:細胞培養中,與培養無關得雜質得混入培養系統統稱為污染。◆空氣:最主要途徑,消毒不嚴格,季節、凈化工作臺故障、濕度、溫度、周邊環境等。◆器材清洗消毒不徹底◆操作:基本功不扎實、不認真、不規范、交叉污染、器具消毒不嚴格等。◆血清:制備水平低,支原體或病毒污染。◆組織樣本四、細胞培養得污染和檢測最嚴峻得挑戰-污染(contamination)

細胞培養得污染問題十分重要,一旦發生污染,將導致前功盡棄。所以細胞培養一定要建立無菌觀念。遇到培養污染要分析原因,及時處理。培養細胞一旦發生污染多數將無法挽回,加入抗生素也基本無能為力。特別就是霉菌和細菌。

1、細胞培養中常見得污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現以下情況時培養得細胞可能有污染:a、培養液得酸堿度發生異常得改變。b、培養液出現混濁。c、光鏡觀察到菌絲和顆粒。d、細胞出現死亡或增殖緩慢等2、常見污染及判斷2、細菌污染:常見革蘭氏陰性菌(白色葡萄球菌)、大腸桿菌、假單胞菌。現象:初期變化不明顯,后期培養液渾濁,鏡下可見菌體。預防:青霉素和鏈霉素可預防。3、真菌污染:常見煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。特點:大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養液表面;鏡下呈絲狀、管狀或樹枝狀,縱橫交錯,散在細胞周邊和細胞之間。抗真菌制劑可預防和排除真菌污染。4、支原體污染:介于細菌和病毒之間,能獨立生活得最小微生物。最常見、不易察覺;大小介于0、2-2μm,約1%可通過濾菌器對酸耐受性差,對熱較敏感,青霉素無效。“正常”感覺。支原體污染細胞后,能抑制細胞代謝和生長,改變核酸合成,影響細胞得抗原性,引起細胞染色體改變,干擾DNA得復制,以及具有類病毒作用。在培養細胞初期,由于支原體對細胞得繁殖影響較小而往往被忽略。

支原體檢測方法和處理1)熒光技術檢測:支原體含有DNA,能與一種熒光染料Hoechest33258特異性