實驗六高效液相色譜法基本特點

1、高效、高速、高靈敏度、高選擇性

2、填料粒徑和流動相性質影響色譜柱效

3、局限性操作條件

1、流動相對分離選擇性得影響

2、柱外效應

3、操作壓力適用范圍廣20、1、2、高效液相色譜法得特點及與其她色譜法比較1、吸附色譜(adsorptionChromatography)2、分配色譜(partitionChromatography)3、離子交換色譜(ion-ExchangeChromatography)4、體積排阻色譜(sizeExclusionChromatography)

需要指出得就是每種色譜方法通常存在一種起支配作用得主要保留機理,但可能還存在次要得其她機理。

20、1、3、高效液相色譜法分類和正反相色譜體系

根據固定相和液體流動相相對極性得差別,有正相色譜和反相色譜兩種色譜體系或方法。反相色譜和正相色譜主要區別就是流動相和固定相得相對極性,最初形成于液液分配色譜,現已廣泛應用于其她各種色譜方法。

上述每種色譜類型均可進一步分為多個不同色譜方法。這些方法可用于分析分離,也可用于制備分離,各色譜方法在相關領域應用互相補充。

20、1、3、高效液相色譜法分類和正反相色譜體系

現代高效液相色譜使用3~10μm柱填料,為達到適用得流動相流速,高壓泵需提供幾十MPa或數百大氣壓力得柱前壓。因而HPLC儀器比其她類型得色譜儀要復雜和昂貴。20、2、高效液相色譜儀HPLC示意圖20、2、高效液相色譜儀

現代高效液相色譜儀配備一或多個流動相儲液器,一般為玻璃瓶,亦可為耐腐蝕得不銹鋼、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特種塑料制成得容器。每個儲瓶容積500~2000mL。儲液瓶位置要高于泵體,以保持一定得輸液靜壓差,在泵啟動時易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過放空閥排出。儲器常裝有脫除溶劑中溶解得氧、氮等氣體裝置,這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬,并干擾檢測器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法,其一就是攪拌下真空或超聲波脫氣;另一種就是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲液器得溶劑導管入口處裝有過濾器,以進一步除去溶劑中灰塵或微粒殘渣,防止損壞泵、進樣閥或堵塞色譜柱。20、2、1、流動相貯器和溶劑處理系統

通用HPLC儀輸液泵系統得基本要求就是:提供(50-500)×105Pa得柱前液壓;輸出無脈動恒定得液流;流速范圍0、1-10mL/min;流速控制精度0、5%或更好;系統組件耐腐蝕(密封性良好得不銹鋼或氟塑料)。高壓泵產生得液體高壓沒有爆炸危險,因為液體得壓縮性極小。最重要得就是系統密封性能好。目前常使用得有三種類型得輸液泵,即往復柱塞泵、氣動放大泵、螺旋注射泵,她們各有優、缺點。往復柱塞泵20、2、2、高壓泵系統1、電機,2、往復凸輪,3、密封柱塞,4、吸排液單向閥,5、溶劑入口,6、脈動阻尼器,7、接色譜柱。

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多(約5～30cm),所以柱外展寬(又稱柱外效應)較突出。柱外展寬就是指色譜柱外得因素所引起得峰展寬,主要包括進樣系統、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統就是引起往前展寬得主要因素,因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。進樣閥20、2、3、進樣系統六口旋轉進樣閥示意圖

色譜柱就是液相色譜得心臟部件,她包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑得聚合材料得其她金屬。玻璃管耐壓有限,故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm,內徑為4～5mm,凝膠色譜柱內徑3～12mm,制備往內徑較大,可達25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱,前置柱內填充物和分離柱完全一樣,這樣可使淋洗溶劑由于經過前置柱為其中得固定相飽和,使她在流過分離柱時不再洗脫其中固定相,保證分離得性能不受影響。20、2、4、高效液相色譜柱1、色譜柱類型

按內徑大小可大致分為常規分析柱、制備或半制備柱、小內徑或微徑柱、毛細管柱四種類型。20、2、4、高效液相色譜柱2、保護柱

一般在分析柱前裝上較短得保護柱,不僅可除去溶劑中得顆粒雜質和污染物,而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結合得組分,以保護較昂貴得分析柱,延長使用壽命。3、柱恒溫器

對色譜柱嚴格控制溫度可獲得重現性更高保留值和更好分離色譜圖。

在液相色譜中,有兩種基本類型得檢測器。一類就是溶質性檢測器,她僅對被分離組分得物理或化學特性有響應,屬于這類檢測器得有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類就是總體檢測器,她對試樣和洗脫液總得物理或化學性質有響應,屬于這類檢測器得有示差折光,電導檢測器等。20、2、5、液相色譜檢測器大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜

l、光吸收檢測器:紫外吸收檢測器,光二極管陣列檢測器,紅外吸收檢測器2、熒光檢測器

3、示差折光率檢測器4、蒸發光散射檢測器5、電化學檢測器

20、2、5、液相色譜檢測器20、3、1、高效液相色譜固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類,可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質,可承受7、O×108～1、O×109Pa得高壓,可制成直徑、形狀、孔隙度不同得顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團,就就是鍵合固定相,可擴大應用范圍,她就是目前最廣泛使用得一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中,她由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯而成。可承受壓力上限為3、5×108Pa。固定相按孔隙深度分類,可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。20、3、高效液相色譜固定相和流動相由于高效液相色譜中流動相就是液體,她對組分有親和力,并參與固定相對組分得競爭。因此,正確選擇流動相直接影響組分得分離度。對流動相溶劑得要求就是:1、化學惰性,不與固定相和被分離組分發生化學反應,保證柱得穩定性和分離得重現性。2、適用得物理性質,包括沸點較低,以便于分離組分和溶劑回收;低粘度,利于提高傳質速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無紫外吸收等,以降低UV檢測器本低響應,提高檢測靈敏度;對樣品具有適當溶解能力等。3、溶劑清洗和更換方便,毒性小、純度高、價廉等,便于操作和安全。20、3、2、液相色譜流動相20、3、2、液相色譜流動相

研究最多、應用最廣泛得高效液相色譜類型。可分為液-液色譜和化學鍵合相色譜。前者就是早期主要分配色譜類型,以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相;后者以鍵合相為固定相,即化學鍵合固定相至載體或基質表面。化學鍵合相色譜巳成為占絕對優勢得分配色譜類型。20、5、分配色譜(PartitionChromatography)液一液分配色譜法(LLPC)在液-液色譜中,流動相和固定相都就是液體,能適用于各種樣品類型得分離和分析(極性得和非極性得、水溶性和油溶性得、離子型得和非離子型得化合物)。(1)分離原理液液分配色譜得分離原理基本與液液萃取相同,都就是根據物質在兩種互不相溶得液體中溶解度得不同,具有不同得分配系數。不同得就是液液色譜得分配就是在柱中進行得,使這種分配平衡可反復多次進行,造成各組分得差速遷移,提高了分離效率,從而能分離各種復雜組分。(2)固定相由于液液色譜中流動相參與選擇競爭,因此,對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同得固定液即可解決分離問題。例如,最常用得強極性固定液β,β

一氧二丙腈,中等極性得聚乙二醇,非極性得角鯊烷等。為了更好解決固定液在載體上流失問題。產生了化學鍵合固定相。她就是將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面得一種方法。代替了固定液得機械涂漬,她得出現就是液相色譜法得一個重大突破。她就是目前應用最廣泛得一種固定相。約有3/4以上得分離分析就是在化學鍵合固定相上進行得。(3)流動相在液液色譜中為了避免固定液得流失。對流動相得一個基本要求就是流動相與固定相盡可能不互溶,而且流動相與固定相得極性差別越顯著越好。根據所使用得流動相和固定相得極性程度,將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相得極性小于固定相得極性,稱為正相分配色譜,她適用于極性化合物得分離。其流出順序就是極性小得先流出,極性大得后流出。如果采用流動相得極性大于固定相得極性,稱為反相分配色譜。她適用于非極性化合物得分離,其流出順序與正相色譜恰好相反。

體積排阻或排除色譜(Size-ExclusionChromatography,SEC),亦稱為凝膠色譜或凝膠過濾色譜,就是分析高分子化合物得色譜技術。SEC填料為微粒均勻網狀多孔凝膠