第六章體外放射分析技術(shù)

Invitroradioassay山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院體外放射分析技術(shù)體外分析發(fā)展史體外放射分析技術(shù)Yalow

Berson

體外放射分析技術(shù)一、定義以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標(biāo)記的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進(jìn)行的微量生物活性物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。體外放射分析技術(shù)二、分類:體外分析技術(shù)體外放射分析體外非放射分析放射性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析放射性非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析放射免疫分析

(radioimmunoassay,

RIA)免疫放射分析(immunoradiometricassay,

IRMA)酶免疫分析(EIA)化學(xué)發(fā)光免疫分析

(CLIA)

熒光免疫分析(FIA)體外放射分析技術(shù)

放射免疫分析

radioimmunoassay,RIA體外放射分析技術(shù)一、RIA的基本原理（一）競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合反應(yīng)：放射免疫分析是在體外條件下，由足量的非標(biāo)記抗原（Ag）與定量的標(biāo)記抗原（*Ag）對(duì)限量的特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合反應(yīng)。體外放射分析技術(shù)分析原理*Ag+AbAg+*Ag-Ab+*AgAg-Ab+Ag條件：*Ag與Ag免疫活性相同*Ag與Ab恒量*Ag與Ag總量大于Ab有效結(jié)合位點(diǎn)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)Ag*與Ag由于免疫化學(xué)性質(zhì)一致，共同競(jìng)爭(zhēng)性與Ab結(jié)合，當(dāng)Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*與Ag之和大于Ab時(shí)，則Ag*-Ab復(fù)合物的形成受Ag含量的制約，二者之間存在竟?fàn)幰种频暮瘮?shù)關(guān)系，即隨著Ag濃度的增加，Ag*-Ab復(fù)合物就減少，因?yàn)锳g*對(duì)Ab的結(jié)合被Ag競(jìng)爭(zhēng)性抑制。根據(jù)這一函數(shù)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求出被測(cè)抗原的含量體外放射分析技術(shù)（二）劑量反應(yīng)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)記物與被測(cè)物之間的函數(shù)關(guān)系可以用劑量反應(yīng)曲線來表示。劑量反應(yīng)曲線是用一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原反應(yīng)而繪制出來的，所以又叫標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)抗原(標(biāo)準(zhǔn)品)是廠家在試劑盒中提供的已知?jiǎng)┝康姆菢?biāo)記抗原。體外放射分析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原和一定量的標(biāo)記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)；在反應(yīng)達(dá)到平衡后，利用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法分離B和F；分別測(cè)量B和F的放射性；用反應(yīng)變量（如B/F）作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量作為橫坐標(biāo)（即一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作一條曲線，就得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)反應(yīng)變量的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，這就是劑量反應(yīng)曲線。體外放射分析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線體外放射分析技術(shù)二、RIA的基本步驟：實(shí)驗(yàn)由兩部分組成：1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：用一系列濃度遞增的標(biāo)準(zhǔn)品（oAg），在嚴(yán)格相同的條件下同*Ag競(jìng)爭(zhēng)與Ab結(jié)合反應(yīng)，以oAg的劑量為橫坐標(biāo)，*Ag.Ab結(jié)合率（B%）為縱坐標(biāo)制得刻度曲線（Calibrationcurve）；2.樣本測(cè)定：同等條件下，待測(cè)樣本可獲得一定的B%，由此可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得待測(cè)物（oAg）的含量。體外放射分析技術(shù)三、質(zhì)量控制(QualityControl):目的：為了獲得準(zhǔn)確可靠的測(cè)定結(jié)果

室間：某一地區(qū)/全國性機(jī)構(gòu)就一些分析項(xiàng)目質(zhì)控對(duì)各實(shí)驗(yàn)室所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較室內(nèi)：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部對(duì)每次分析結(jié)果的質(zhì)量進(jìn)行檢查和控制

誤差：

A.隨機(jī)誤差(RandomError)：

放射性測(cè)量的統(tǒng)計(jì)誤差不可避免，呈高斯分

實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)誤差

布，以精密度評(píng)價(jià)

試劑配制等

B.系統(tǒng)誤差(SystematicError)：通過努力可以消除

由某一固定因素引起，儀器、試劑、操作程序、試驗(yàn)方法等

體外放射分析技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)：

生物制劑，穩(wěn)定性受多種因素影響，需有質(zhì)量控制措施（QualityControl)

靈敏度高：可達(dá)10-9―10-12g(mol)

特異性強(qiáng)：抗原抗體結(jié)合具有很高的特異性

應(yīng)用范圍廣：凡能制備相應(yīng)抗體的生物活性物質(zhì)，只要含量不低于RIA探測(cè)極限，都可建立

操作簡便：所需試劑少，測(cè)量及數(shù)據(jù)處理易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化主要缺點(diǎn)：

靈敏度很難超過10-15g水平體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)ThankYou!體外放射分析技術(shù)非競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫分析

(免疫放射分析IRMA)一.基本原理：放射核素標(biāo)記在抗體上，與待測(cè)抗原結(jié)合后，用一定手段將多余抗體除去，測(cè)定復(fù)合物的放射性，其活度與待測(cè)抗原呈正相關(guān)

Ag+

*AbAg.*Ab+

*Ab(過量）(B)(F)體外放射分析技術(shù)IRMA與RIA的主要區(qū)別：

RIAIRMA

1.競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析2.三種主要反應(yīng)試劑兩種主要反應(yīng)試劑3.標(biāo)記抗原標(biāo)記抗體4.復(fù)合物放射活度與復(fù)合物放射活度與待測(cè)抗原呈負(fù)相關(guān)待測(cè)抗原呈正相關(guān)5.NSB主要影響高劑NSB主要影響低劑量反應(yīng)量反應(yīng)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)IRMA主要優(yōu)點(diǎn)：

溫育時(shí)間短：37℃溫育2

3小時(shí)即可靈敏度高：是RIA的10

100倍

測(cè)量范圍寬：標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬,RIA為2個(gè)數(shù)量級(jí)，IRMA可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)特異性強(qiáng)：應(yīng)用針對(duì)某一抗原決定簇的單抗,不易發(fā)生交叉反應(yīng)IRMA主要缺點(diǎn)：

需要二種McAb

抗體用量大體外放射分析技術(shù)非放射標(biāo)記的免疫分析法

化學(xué)發(fā)光分析時(shí)間分辨熒光分析酶免疫分析體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)電化學(xué)發(fā)光（ECL）：

ECL是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫之后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)

ECL是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)，實(shí)際上包括了電、化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程，故是化學(xué)發(fā)光的一種發(fā)展，電化學(xué)反應(yīng)在電極表面周而復(fù)始的進(jìn)行，光信號(hào)明顯增強(qiáng)，因而ECL與CL的差異在于：ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，CL是通過化合物簡單的混合啟動(dòng)的發(fā)光反應(yīng)。ECL反應(yīng)更易精確控制，更具靈活性。ECL反應(yīng)原理：化學(xué)發(fā)光反應(yīng)導(dǎo)致光的發(fā)射是來自釕（Ru）化合物的電的激發(fā)，而不是化學(xué)的激發(fā)。體外放射分析技術(shù)二.時(shí)間分辨熒光免疫

（time-resolvedfluorescenceimmunossay

—TRFIA）稀土族中的鑭系元素（Eu、Tb、Sm、Dy等）以離子價(jià)態(tài)時(shí)，受到紫外光或激光等激發(fā)后，會(huì)以熒光的形式發(fā)射光譜，其激發(fā)光光譜的波長和發(fā)射熒光的強(qiáng)度因離子不同而有差異，而且具有相當(dāng)長的衰減時(shí)間，這樣就為時(shí)間分辨熒光(TRF)所發(fā)射的信號(hào)采集和多標(biāo)記的應(yīng)用提供了條件。TRFIA是一種以鑭系元素螯合物標(biāo)記抗體或抗原，利用時(shí)間分辨熒光光度計(jì)測(cè)量法排除檢品中非特異性熒光干擾的測(cè)量技術(shù)。銪：（Eu—europium）鋱：（Tb—terbium）釤：（Sm—samarium）鏑：（Dy—dysprosium）體外放射分析技術(shù)原理：

TRFIA的標(biāo)記物由鑭系元素螯合物與Ab或Ag組成。待測(cè)物通過免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物上，標(biāo)有鑭系元素（Eu3+），經(jīng)紫外線激發(fā)后會(huì)發(fā)出熒光。但連接在復(fù)合物上的Eu發(fā)射的熒光很弱，需要將其游離出來再形成一個(gè)能發(fā)射強(qiáng)熒光的絡(luò)合物。因此在免疫反應(yīng)結(jié)束后，需向體系中加入一種“熒光增強(qiáng)劑”，大大增加信號(hào)，所以該技術(shù)有時(shí)也稱為解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析（DELFIA）。所謂時(shí)間分辨是指Eu3+受激活后產(chǎn)生壽命較長的熒光，而一般干擾熒光壽命較短，固可用儀器把測(cè)量時(shí)間定在每次激發(fā)后的數(shù)百

s之后才開始，干擾熒光已衰減到很低水平，所取熒光信號(hào)是熒光衰減過程的中間一段。螯合劑：異硫氰酸苯基-EDTA