細胞工程

細胞工程是指應(yīng)用細胞生物學、分子生物學和發(fā)育生物學等多學科的原理和方法，通過細胞器、細胞或組織水平上的操作，有目的地獲得細胞、組織、器官、個體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。動物細胞工程植物細胞工程原理操作水平目的植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交哈伯蘭特提出了細胞全能性的理論，但相關(guān)的實驗嘗試沒有成功。斯圖爾德等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細胞可以分化為胚，為細胞全能性理論提供了強有力的支持。科金用真菌的纖維素酶分解番茄根的細胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。古哈等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時，首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的胚。卡爾森誘導煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得了第一株體細胞種間雜種植株。土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。之后，該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學領(lǐng)域，促進了植物細胞工程與分子生物學技術(shù)的緊密結(jié)合。1902年1958年1960年1964年1971年1974年科技探索之路植物細胞工程的發(fā)展歷程第2章細胞工程第1節(jié)植物細胞工程世界上最貴的蘭花1500萬/株——幽靈蘭情境導入情境導入詠懷蘭為王者香，芬馥清風里。從來巖穴姿，不競繁華美。植物組織培養(yǎng)技術(shù)

思考：高潔、典雅的蘭花頗受人喜歡。但其繁殖率低，價格不菲，如何讓它大量、快速地繁殖呢？最貴的蘭花1500萬/株——幽靈蘭一、植物細胞工程的基本技術(shù)指將離體的植物器官、組織或細胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導其形成完整植株的技術(shù)。植物細胞的全能性1.概念2.原理：生殖方式一般是無性生殖分裂方式有絲分裂外植體

細胞經(jīng)過分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細胞的潛能。（1）原因：高度分化的細胞仍含有該物種的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個體所需要的全套基因。葉子花瓣花粉細胞植物體（2）大小比較：①受精卵＞胚胎干細胞＞生殖細胞＞體細胞②植物細胞＞動物細胞一般情況下，隨著細胞分化程度的不斷提高，細胞的全能性逐漸降低。一、植物細胞工程的基本技術(shù)植物細胞的全能性2.原理：

生物體內(nèi)的細胞在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會選擇性的表達，即發(fā)生細胞分化。如芽原基的細胞只能發(fā)育為芽，葉原基的細胞只能發(fā)育為葉。（3）生物體內(nèi)細胞并不都表現(xiàn)全能性原因：植物細胞的全能性2.原理：一、植物細胞工程的基本技術(shù)潛能表現(xiàn)出全能性怎么才能表現(xiàn)出來呢？1958年Steward利用胡蘿卜韌皮部誘導分化產(chǎn)生了胚狀體，這是人類第一次獲得了人工胚狀體，并獲得個體植株。（必修一

P118-121）（4）表現(xiàn)出全能性的條件：一、植物細胞工程的基本技術(shù)①離體②一定的營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素③適宜的溫度、pH等外界條件④無菌環(huán)境接種外植體離體培養(yǎng)的植物器官、組織或細胞脫分化誘導愈傷組織無組織結(jié)構(gòu)、松散的薄壁細胞團離體條件下已分化的細胞經(jīng)過誘導，失去特有的結(jié)構(gòu)和功能，重新獲得分裂能力誘導生芽再分化愈傷組織能重新分化成芽、根等器官誘導生根移栽成活一、植物細胞工程的基本技術(shù)3.植物組織培養(yǎng)的流程：一、植物細胞工程的基本技術(shù)3.植物組織培養(yǎng)的流程：(1)脫分化：已經(jīng)分化的細胞，經(jīng)過誘導，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化細胞的過程。(2)愈傷組織：排列疏松、無規(guī)則，高度液泡化、不定形的薄壁組織團塊。(3)再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化出根或芽等器官的過程。外植體愈傷組織芽、根完整植株脫分化再分化生長發(fā)育注意：過程中涉及的生命活動只有細胞增殖（有絲分裂），沒有細胞分化。

該培養(yǎng)過程一般不需要光照注意：過程中涉及的生命活動：既有細胞增殖（有絲分裂），又有細胞分化。

需要給予適當光照，誘導葉綠素的合成，使試管苗能夠進行光合作用。愈傷組織見光后愈傷組織變?yōu)榫G色愈傷組織一、植物細胞工程的基本技術(shù)（1）脫分化與再分化的比較：脫分化再分化過程外植體→愈傷組織愈傷組織→幼苗分裂、分化有分裂，無分化有分裂和分化結(jié)果形成愈傷組織形成根、芽需要條件a.離體、適宜的營養(yǎng)c.生長素與細胞分裂素的比例適中d.一般不需光a.離體、適宜的營養(yǎng)c.生長素與細胞分裂素的比例高或低誘導生根或生芽d.光照（誘導葉綠素的合成，使試管苗能夠進行光合作用。）

生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素。它們的濃度、比例都會影響植物細胞的發(fā)育方向。一、植物細胞工程的基本技術(shù)（2）決定植物脫分化、再分化的關(guān)鍵因素：外植體愈傷組織試管苗完整植株脫分化芽、根等再分化關(guān)鍵激素生長素和細胞分裂素細胞分裂素生長素

芽分化愈傷組織根分化生長素用量/細胞分裂素用量結(jié)果比值≈1比值＞1比值＜1促進根的分化促進芽的分化促進愈傷組織的形成

巧記：高根低芽中愈傷一、植物細胞工程的基本技術(shù)二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)①植物細胞一般具有

；全能性②在一定的激素和營養(yǎng)等條件的誘導下，已經(jīng)分化的細胞可以經(jīng)過

，

和

，形成

，長出

，進而發(fā)育成

；脫分化再分化胚狀體芽和根完整的植株③植物激素中

和

是啟動

、

和

的關(guān)鍵激素，它們的

、

等都會影響植物細胞的發(fā)育方向；生長素細胞分裂素細胞分裂脫分化再分化濃度比例1.實驗原理：2.目的：（1）了解植物組織培養(yǎng)的基本原理（2）了解生長素和細胞分裂素的濃度、用量比例對菊花愈傷組織形成和分化的影響（3）嘗試進行植物組織培養(yǎng)（1）外植體：幼嫩的菊花莖段(容易誘導形成愈傷組織)（2）體積分數(shù)為70%的酒精：對手、超凈工作臺、外植體進行消毒（3）質(zhì)量分數(shù)為5%左右的次氯酸鈉溶液:（4）無菌水:清洗外植體二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)3.材料：對外植體進行消毒（5）MS培養(yǎng)基水（去離子水）無機營養(yǎng)（大量元素、微量元素）有機營養(yǎng)（蔗糖、維生素、氨基酸）天然附加物植物激素（生長素、細胞分裂素等）作為碳源、提供能量、調(diào)節(jié)滲透壓二者的濃度及用量的比例等都會影響實驗結(jié)果MS培養(yǎng)基中為什么用蔗糖而不用葡萄糖？

分析：蔗糖同樣可以作為植物細胞的碳源和能源物質(zhì)。配制相同質(zhì)量分數(shù)的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓要明顯______（低于/高于）葡萄糖，若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細胞脫水而生長不良。同時，植物細胞吸收蔗糖的速率要明顯______（慢于/快于）吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的滲透壓可較長時間地保持相對穩(wěn)定。此外，微生物生長所需的最適合的碳源是__________，因此，采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可在一定程度上減少___________________。低于慢于葡萄糖微生物的污染二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)3.材料：（5）MS培養(yǎng)基蔗糖的作用：作為碳源，提供能量，調(diào)節(jié)滲透壓二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)4.步驟：（1）制備外植體消毒：切割：（無菌操作）酒精30S無菌水2-3次次氯酸鈉溶液30min材料：幼嫩的菊花莖段2-3次無菌水洗消毒與無菌水沖洗切割與接種用酒精擦拭雙手和超凈工作臺臺面。將流水充分沖洗后的外植體。將消過毒的外植體置于無菌的培養(yǎng)皿中，用無菌濾紙吸去表面的水分。用解剖刀將外植體切成0.5~1cm長的小段。考慮消毒效果和材料耐受性二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)4.步驟：超凈工作臺或接種箱產(chǎn)生愈傷組織在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3~1/2插入誘導愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上作好標記。將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養(yǎng)瓶置于18~22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長情況。（2）接種到誘導愈傷組織培養(yǎng)基脫分化避光形成愈傷組織有光時，往往容易形成維管組織，而不易形成愈傷組織。二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)4.步驟：培養(yǎng)15~20d后，將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導生芽的培養(yǎng)基上。長出芽后，再將其轉(zhuǎn)接到誘導生根的培養(yǎng)基上，進一步誘導形成試管苗。（3）接種到誘導生芽培養(yǎng)基（4）接種到誘導生根培養(yǎng)基若先生根后面就不易生芽生長素和細胞分裂素的比例和濃度都會影響植物細胞的發(fā)育方向低→利于芽的分化細胞分裂素生長素高→利于根的分化適中→利于愈傷組織的形成誘導出芽誘導生根移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長幾日。用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長壯后再移栽入土。每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。試管苗移栽培養(yǎng)室二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)4.步驟：（5）試管苗移栽固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培珍珠巖：是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結(jié)構(gòu)，所以被命名為珍珠巖。蛭石：是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)5.注意事項：①實驗中使用的培養(yǎng)基和所有的器械都要_____________。接種操作必須在_______________進行，并且每次使用后的器械都要__________。②接種時注意外植體的方向，不要__________。③誘導愈傷組織期間一般_____________，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，每日______________________________。滅菌酒精燈火焰旁滅菌倒插不需要光照需要給予適當時間和強度的光照形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基中二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)6.結(jié)果與分析：（1）在植物組培過程中，為什么要進行一系列的消毒，滅菌，并且要求

無菌操作？用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合某些微生物的生長，如一些細菌、真菌等的生長。培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄，因此要進行嚴格的無菌操作。（2）為什么切取胡蘿卜根的形成層，其他部分也能培養(yǎng)成小植株嗎？胡蘿卜根形成層容易誘導成愈傷組織，其他部分如葉、花也能培養(yǎng)成小植株，只是稍微困難些。二、探究實踐-菊花的組織培養(yǎng)6.結(jié)果與分析：（1）導致外植體被污染的原因可能有：培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底；外植體消毒不徹底；操作過程不符合無菌操作要求等。（2）觀察實驗結(jié)果，看看是否培養(yǎng)出了愈傷組織，記錄多長時間長出了愈傷組織。從剛接種的外植體到長出愈傷組織一般需要2周左右的時間。統(tǒng)計更換培養(yǎng)基后愈傷組織進一步分化成芽和根的比例和時間。（3）做好統(tǒng)計和對照，填好結(jié)果記錄表，培養(yǎng)嚴謹?shù)目茖W態(tài)度。從實驗的第一步開始就要做好實驗記錄，可以分組配制不同的培養(yǎng)基，如誘導愈傷組織的培養(yǎng)基、誘導生芽的培養(yǎng)基等，還可以進行不同配方的比較。課堂小結(jié)根、芽胚狀體脫分化再分化培養(yǎng)條件：①無菌②營養(yǎng)物質(zhì)③適宜環(huán)境條件（溫度、PH、光等）④植物激素：

細胞分裂素生長素遮光一定的光照愈傷組織離體的植物器官、組織或細胞（外植體）芽發(fā)育成葉，葉肉細胞中葉綠素的合成需要光照試管苗有光時，往往容易形成維管組織，而不易形成愈傷組織。試管苗一般在高濕、弱光、恒溫等條件下培養(yǎng)生長試管苗的光合作用能力弱，在移栽前應(yīng)給予較強光照閉瓶煉苗，以促進幼苗向自養(yǎng)苗轉(zhuǎn)化。情境導入1.通過有性雜交能實現(xiàn)嗎？為什么？西紅柿土豆×【思考.討論】不能，不同種物種間存在生殖隔離植物體細胞雜交技術(shù)2.有沒有方法可以打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，獲得“番茄-馬鈴薯雜種植株”呢？1.概念：

將不同來源的植物細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種細胞培育成新植物體的技術(shù)。融合實例+=白菜甘藍白菜-甘藍三、植物體細胞雜交技術(shù)參考動物細胞融合，若是植物細胞之間的雜交，則應(yīng)先做什么？得到雜種細胞后，如何培育成植株？三、植物體細胞雜交技術(shù)2.過程：（1）去除細胞壁：B細胞A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體去壁去壁A細胞酶解法利用酶的專一性去除細胞壁，獲得原生質(zhì)體三、植物體細胞雜交技術(shù)①方法：②原理：③目的：（纖維素酶和果膠酶）注意：去除細胞壁的植物細胞是否需要保證滲透壓穩(wěn)定？需要，可以加入山梨醇和甘露醇來穩(wěn)定滲透壓！防止細胞吸水漲破或失水皺縮。細胞壁細胞膜細胞質(zhì)液泡細胞核

指的是脫去細胞壁的細胞。動物細胞也可看做是原生質(zhì)體。原生質(zhì)體成熟植物細胞的細胞膜、液泡膜和介于這兩層膜之間的細胞質(zhì)。原生質(zhì)層區(qū)分原生質(zhì)體與原生質(zhì)層【注意】質(zhì)壁分離的“質(zhì)”指的是原生質(zhì)層三、植物體細胞雜交技術(shù)B細胞A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體去壁去壁A細胞正在融合的原生質(zhì)體融合三、植物體細胞雜交技術(shù)2.過程：（2）誘導融合：關(guān)鍵環(huán)節(jié)①原理：②方法：物理：電融合法、離心法化學：聚乙二醇（PEG）法高Ca2+-高pH融合法細胞膜具有流動性物理方法&化學方法B細胞A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體去壁去壁A細胞正在融合的原生質(zhì)體融合再生出細胞壁雜種細胞①植物細胞融合完成的標志:融合的原生質(zhì)體重新產(chǎn)生細胞壁，形成雜種細胞。②直接參與細胞器:高爾基體思考：細胞融合后，共有幾種細胞類型？符合要求的是哪種？三、植物體細胞雜交技術(shù)2.過程：（3）再生細胞壁：細胞融合后，共有幾種細胞類型？符合要求的是哪種？若只考慮兩兩融合有三類：①未融合的細胞②兩兩融合的細胞③多細胞融合體AAABBB篩選AB三、植物體細胞雜交技術(shù)2.過程：（3）再生細胞壁：注意：融合后雜種細胞需要經(jīng)過篩選才能獲得所需要的雜種細胞！B細胞A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體去壁去壁A細胞正在融合的原生質(zhì)體融合再生出細胞壁雜種細胞愈傷組織雜種植株脫分化再分化①細胞雜交完成的標志:培育成新植物體三、植物體細胞雜交技術(shù)2.過程：（4）植物組織培養(yǎng)：B細胞A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體去壁去壁A細胞正在融合的原生質(zhì)體融合再生出細胞壁雜種細胞愈傷組織雜種植株脫分化再分化植物細胞融合植物組織培養(yǎng)細胞膜的流動性細胞的全能性三、植物體細胞雜交技術(shù)2.過程：（4）植物組織培養(yǎng)：三、植物體細胞雜交技術(shù)

思考1：科學家已經(jīng)培育出“番茄一馬鈴薯”超級雜種植株，但并未出現(xiàn)，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯的性狀，可能的原因是什么？

提示：馬鈴薯基因組的____________可能影響了番茄基因組的表達，番茄基因組的表達產(chǎn)物也可能影響了馬鈴薯基因組的表達，導致融合植株細胞中的基因不能______表達。表達產(chǎn)物有序

思考2：據(jù)報道，某男子培育出一株奇怪的植株，實現(xiàn)了“地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯”，你認為該男子可能是利用什么方法獲得的該植株？分析：______________________________________________________。接穗砧木嫁接

以土豆植株為砧木，以番茄植株為接穗實戰(zhàn)訓練

1.識圖：數(shù)字代表過程，字母代表細胞、組織或植株①_______________a/b_____________②_______________c_______________③_______________d_______________④_______________e_______________⑤_______________f_______________①②③___________④⑤____________去除細胞壁原生質(zhì)體原生質(zhì)體間的融合正在融合的原生質(zhì)體再生出新的細胞壁雜種細胞脫分化愈傷組織再分化雜種植株植物細胞融合植物組織培養(yǎng)根據(jù)植物體細胞雜交技術(shù)的相關(guān)原理，小組合作思考討論完成問題。

3.植物體細胞雜交技術(shù)意義？2.雜種細胞的染色體數(shù)是多少？雜種細胞染色體組數(shù)是多少？1.植物體細胞雜交屬于哪種變異類型？4.植物體細胞雜交有何優(yōu)缺點？A植物的染色體數(shù)目為2n，基因型為AaBb；B植物的染色體數(shù)目為2m，基因型為CcDd。現(xiàn)通過植物體細胞雜交技術(shù)獲得這兩種植物的雜種植株，請回答下列問題：三、植物體細胞雜交技術(shù)生殖類型變異類型染色體數(shù)染色體組數(shù)基因組成無性繁殖，育種過程中不遵循孟德爾定律染色體數(shù)目變異兩親本染色體數(shù)之和。2n+2m兩親本染色體組數(shù)之和。2+2兩親本基因型之和。AaBbCcDdAaBbCcDd三、植物體細胞雜交技術(shù)3.變異類型：植物體細胞雜交后代的遺傳變化植物體細胞雜交育種四倍體雜交育種誘導多倍體四倍體二倍體如何處理植株使其可育？看減數(shù)分裂聯(lián)會、配對能否正常進行！①若親本植株可育，

則雜種植株可育。②雜種植株是不同于

親本的新物種。三、植物體細胞雜交技術(shù)3.變異類型：5.優(yōu)缺點：①優(yōu)點打破遠緣親本雜交生殖隔離，擴展雜交親本組合范圍。②缺點可能雜交不成功

/雜交成功但不是人們想要的性狀。三、植物體細胞雜交技術(shù)打破生殖隔離，克服遠緣雜交不親和的障礙，培育植物新品種。4.意義：有關(guān)植物體細胞雜交的3個易錯點(1)

植物體細胞雜交的結(jié)果最終要經(jīng)過組織培養(yǎng)形成雜種植株。(2)植物體細胞雜交過程中沒有有性生殖細胞的結(jié)合，因此不屬于有性生殖，應(yīng)為無性生殖。(3)

雜種植株的染色體數(shù)通常是兩親本細胞染色體數(shù)目之和，屬于異源多倍體，所以變異類型為染