第10章DNA的生物合成>領頭鏈連續復制而隨從鏈不連續復制，就是復制的

復制(replication)是指遺傳物質的傳代，以母鏈DNA為模半不連續性。

板合成子鏈DNA的過程。第二節DNA復制的酶學和拓撲學變化

第一節復制的基本規律■參與DNA復制的物質：

復制的基本規律>底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP;

>復制的方式---半保留復制(semi-conservative>聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶，

replication)簡寫為DNA-pol;

A雙向復制(bidirectionalreplication)

A模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈；

>半不連續復制(semi-discontinuousreplication)

>引物(primer):提供3-0H末端使dNTP可以依次

一、半保留復制是DNA復制的基本特征

聚合；

■復制的方式一半保留復制

>其他的酶和蛋白質因子。

(semi-conservativereplication)

一、核甘酸和核甘酸之間生成磷酸二酯鍵是復制的基本化

定義：DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單

學反應

鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規律，合

聚合反應的特點：

成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA,一股單

>DNA新鏈生成需引物和模板；

鏈從親代完整地接受過來另一股單鏈則完全從新

>新鏈的延長只可沿5,一3方向進行。

合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列

二、DNA聚合酶催化核甘酸之間聚合

一致。這種復制方式稱為半保留復制。

>全稱:依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent

半保留復制的意義：

DNApolymerase)

按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基

>簡稱：DNA-pol

序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體

活性：

現了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩定性

1.543,的聚合活性

的分子基礎，但不是絕對的。

2.核酸外切酶活性

二、DNA復制從起始點向兩個方向延伸形成雙向復制

A3,f5,外切酶活性：能辨認錯配的堿基對，并將

■雙向復制

(bidirectionalreplication)其水解。

原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方

>5,f3,外切酶活性：能切除突變的DNA片段。

向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙

(-)原核生物的DNA聚合酶分為三型

向復制。>DNA-polI

>真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中

復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一出現的空隙進行填補。

個復制子(replicon)。復制子是獨立完成復制的功木瓜蛋白酶水解：

能單位。

1.小片段，323個氨基酸,5,f3,核酸外切酶

三、DNA一股子鏈復制的方向與解鏈方向相反導致半不連

活性

續復制

2.大片段/Klenow片段，604個氨基酸，DNA

■半不連續復制(semi-discontinuous

replication)聚合酶活性，3,f5,核酸外切酶活性

>順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續進行的，這3.Klenow片段是實驗室合成DNA,進行分子生

物學研究中常用的工具酶。

股鏈稱為領頭鏈(leadingstrand)o

>另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順

著解鏈方向連續延長，這股不連續復制的鏈稱為隨>DNA-polII

從鏈(laggingstrand).復制中的不連續片段稱為DNA-polII基因發生突變，細菌依然能存活。

同崎片段(okazakifragment).

1

DNA-polH對模板的特異性不高，即使在已發生(二)復制的保真性依賴正確的堿基選擇

損傷的DNA模板上，它也能催化核苗酸聚合。因＞DNA聚合酶靠其大分子結構協調非共價(氫鍵)

此認為，它參與DNA損傷的應急狀態修復。與共價(磷酸二酯鍵)鍵的有序形成。

＞DNA-polIII＞噤吟的化學結構能形成順式和反式構型，與相應的

是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。嗑咤形成氫鍵配對，噂吟應處于反式構型。

DNA復制的保真性至少要依賴三種機制：

DNApolIDNApolnDNApolin＞遵守嚴格的堿基配對規律；

分子量(kD)109120250

＞聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；

組成單肽鏈2多亞基不對稱

二聚體＞復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。

分子數/細胞400?20

四、復制中的分子解鏈伴有DNA分子拓撲學變化

核酸外切於活性有無無

基因突變后的致死性可能不可能可能DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈,

它才能起模板作用。

(二)常見的真核細胞DNA聚合酶有五種(-)多種酶參與DNA解鏈和穩定單鏈狀態

DNA-pola:起始引發，有引物酶活性。原核生物復制起始的相關蛋白旗

flg白質《基因)一iffi用名功能

DNA-polp：參與低保真度的復制。UnitA(dnaA)~辨認起始點~

DnuB(dnnB)解4K施修*開DNA雙餓

DNA-polY：在線粒體DNA復制中起催化作用。

l)nu(?(<lnu(')運康和協MDnnH

DNA-pol5:延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。引物廨他化RNA弓［物生成

SSB單鏈DNA自定已解開的單鏈

DNA-pol:在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作結介強白

￡拓撲異樹廊(gyrA,B)理順DZA鏈

用。

＞解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫

鍵，使雙鏈解開成為兩條單鏈。

分子量(kD)16.54.014.012.525.5DNA

5，-3'聚合活性中?高晶＞弓I物酶(primase)—復制起始時催化生成RNA引

核酸外切

物的酶。

唐活性

低保

起始用線粒體延長子填補引物＞單鏈結合蛋白

度DNA(singlestrandedDNAbinding

真

功能發,引DNA復鏈的主空隙，切

復

的

物酶活制要酶，除修復，protein,SSB)一在復制中維持模板處于單鏈狀

制

性解螺旋

博活性態并保護單鏈的完整。

(二拓撲異構酶改變超螺旋狀態、理順

三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復制保真性)DNADNADNA

鏈

的酶學依據

■拓撲異構酶作用特點：

＞復制按照堿基配對規律進行，是遺傳信息能準確傳

＞既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。

代的基本原理。

■拓撲異構酶分類

＞此外還需酶學的機制來保證復制的保真性。

＞拓撲異構酶

(-)核酸外切酶活性在復制中辨認切除錯配堿基并加以I

作用機制：切斷雙鏈中一股鏈,使解鏈

校正DNADNA

旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變為松

＞核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端

弛狀態。反應不需。

把核昔酸依次水解出來的酶，外切酶是有方向性ATP

＞拓撲異構酶

的。n

作用機制：切斷分子兩股鏈，斷端通過切口

例：DNA

旋轉使超螺旋松弛。

A:DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其

利用供能，連接斷端，分子進入負超螺

聚合活性摻入正確配對的底物。ATPDNA

旋狀態。

B:堿基配對正確，DNA-pol不表現活性。

五、DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口

2

■DNA連接酶(DNAligase)作用方式：＞復制的起始需要DNA-pola(引物酶活性)和pol6

連接DNA鏈3--0H末端和相鄰DNA鏈5，-P末端,(解螺旋酶活性)參與。還需拓撲酶和復制因子

使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA(replicationfactor,RF)O

鏈連接成一條完整的鏈。

■功能：＞增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclear

antigen,PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。

＞DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。

PCNA為同源三聚體，具有與E.coliDNA聚合酶W

＞在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。

＞也是基因工程的重要工具酶之一。的B亞基相同的功能和相似的構象，即形成閉合

環形的可滑動DNA夾子，在RFC的作用下PCNA

第三節DNA生物合成過程

結合于引物-模板鏈；并且使獲得持

一、原核生物的DNA生物合成一PCNApol6

續合成能力。PCNA水平也是檢驗細胞增殖的重要

(-)復制起始：DNA解鏈形成引發體

指標。

需要解決兩個問題：

＞細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關

1.DNA解開成單鏈，提供模板。

鍵點。G1-S及02TM的調節，與蛋白激酶活性

2.形成引發體，合成引物，提供3-0H末端。

過程：有關。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因

子而實施調控作用。相關的激酶都有調節亞基即細

1.DNA解鏈

胞周期蛋白(cyclin),和催化亞基即細胞周期蛋白

2.引發體和引物

依賴激酶(cyclindependentkinase,CDK)

含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區域O

的復合結構稱為引發體。一哺乳類動物的周期蛋白和CDK

-CDK相匹配而周期蛋白

引物：是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。_作用點1

CDK2CyclinD1,D2,D3G1期

(二)復制的延長過程：領頭鏈連續復制，隨從鏈不連續

CyclinEG1一湖

復制CyclinAS期

復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式CDK3和CDK4CyclinDI,D2,D3G2期

逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯CDK1(CDC2)CyclinA,BG2TM期

------------------------------

鍵的不斷生成。一

領頭鏈的子鏈沿著5-3,方向可以連續地延長。

＞哺乳類動物細胞內還發現天然抑制CDK的蛋白

同一復制叉上領頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長

質，例如錨蛋白(ankynin)是CDK4的特異性抑制

(三)復制的終止過程：切除引物、填補空缺、連接切口

物，P21蛋白能抑制多種CDK。錨蛋白和P21蛋

＞原核生物基因是環狀DNA,雙向復制的復制片段

白的抑制/活化可使細胞周期開放/關閉，因此被形

在復制的終止點(ter)處匯合。

容為細胞周期的檢查點(checkpoint)蛋白。

二、真核生物的DNA生物合成一

(二)真核生物復制的延長發生DNA聚合酶a/5轉換

＞細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關

＞DNA-pol6和pola分別兼有解螺旋酶和引物酶活

鍵點。G1-S及02fM的調節，與蛋白激酶活性

性。在復制叉及引物生成后,DNA-pol6通過PCNA

有關。

的協同作用逐步取代pola在RNA引物的31-0H

＞蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而

基礎上連續合成領頭鏈。隨從鏈引物也由pola催

實施調控作用。

化合成。然后由PCNA協同，pol6置換pola,繼

(一)真核生物復制的起始與原核基本相似

續合成DNA子鏈。

＞真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復

(三)端粒酶參與解決染色體末端復制問題

制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不

＞染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。

是同步起動。

＞復制中同崎片段的連接，復制子之間的連接。

3

A染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA弓物，去三、噬菌體DNA按滾環方式復制和線粒體DNA按D

除后留下空隙。環方式復制

端粒(telomere):指真核生物染色體線性DNA分子末端的

■滾環復制(rollingcirclereplication):是某些低

結構。

等生物的復制形式，如4)X174和M13噬菌體等。

■端粒的結構特點：

■D環復制(D-loopreplication):是線粒體DNA

＞由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。

(mitochondrialDNA,mtDNA)的復制形式。_

＞末端DNA序列是多次重復的富含G、C堿基的短

＞D-環復制時需合成引物。mtDNA為雙鏈，第一個

序列。

引物以內環為模板延伸。至第二個復制起始點時,

■端粒的功能：

又合成另一個反向引物，以外環為模板進行反向的

＞維持染色體的穩定性

延伸。最后完成兩個雙鏈環狀DNA的復制。復制

＞維持DNA復制的完整性

中呈字母D形狀而得名。

端粒酶(telomerase)

＞D環復制的特點是復制起始點不在雙鏈DNA同一

＞RNA(humantelomeraseRNA,hTR)

位點，內、外環復制有時序差別。

＞端粒酶協同蛋白(humantelomeraseassociated

第五節DNA損傷(突變)與修復

protein1,hTPI)

＞端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasereverse＞DNA突變具體指個別dNMP殘基以至片段DNA在

transcriptase,hTRT)_構成、復制或表型功能的異常變化，也稱為DNA

損傷(DNAdamage),

第四節逆轉錄和其他復制方式

＞從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改

一、逆轉錄病毒的基因組是RNA,其復制方式是逆轉錄

變

＞RNA病毒在細胞內復制成雙鏈DNA的前病毒

一、突變在生物界普遍存在

(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息,

(-)突變是進化、分化的分子基礎

并可在細胞內獨立繁殖。在某些情況下，前病毒基

＞從長遠的生物史看，進化過程是突變的不斷發生所

因組通過基因重組(recombination)，參加到細胞基

造成的。

因組內，并隨宿主基因一起復制和表達。這種重組

＞大量的突變都是屬于這種類型，只是目前還未能認

方式稱為整合(integration)。前病毒獨立繁殖或整

識其發生的真正原因，因而名為自發突變或自然突

合，都可成為致病的原因。

變(spontaneousmutation),

試管內合成cDNA:

(二)只有基因型改變的突變形成DNA的多態性

以mRNA為模板，經逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補

＞這種突變沒有可察覺的表型改變，例如在簡并密碼

的DNA鏈。

子上第三位堿基的改變，蛋白質三項能區段上編碼

分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目的

序列的改變等。這些現象也相當普遍。

基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。.

＞多態性(polymorphism)一詞用來描述個體之間的

二、逆轉錄的發現發展了中心法則基因型差別現象。

＞逆轉錄酶和逆轉錄現象，是分子生物學研究中的重(三)致死性的突變可導致個體、細胞的死亡

大發現。_(四)突變是某些疾病的發病基礎

二、多種化學或物理因素可誘發突變

＞逆轉錄現象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼

有遺傳信息傳代與表達功能。＞大量的突變屬于自發突變，發生頻率只不過在

左右。但由于生物基因組龐大，細胞繁殖速度快，

＞對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到

的病毒致癌理論。_因此它的作用是不可低估的。

＞實驗室用來誘發突變，也是生活環境中導致突變的

因素，主要有物理和化學因素。

4

三、引起突變的分子改變類型有多種＞SOS修復一

＞錯配(mismatch)(-)直接修復系統利用酶簡單地逆轉DNA損傷

＞重排(rearrangement)(二)核苗酸切除修復系統識別DNA雙螺旋變形

框移(frame-shift):＞這是細胞內最重要和有效的修復方式。

＞缺失(deletion)＞其過程包括去除損傷的DNA,填補空隙和連接。

＞插入(insertion)＞主要由DNA-polI和連接酶完成。

(-)錯配可導致編碼氨基酸的改變

＞核昔酸切除修復不僅能夠修復整個基因組中的損

＞DNA分子上的堿基錯配稱點突變(point

傷，而且能拯救因轉錄模板鏈損傷而暫停轉錄的

mutation).

RNA聚合酶,即參與轉錄偶聯修復

＞自發突變和不少化學誘變都能引起DNA上某一堿

基的置換。(transcription-coupledrepair).

＞轉錄偶聯修復的意義在于力各修復酶集中于正在轉

＞點突變發生在基因的編碼區，可導致氨基酸改變。

(二)缺失、插入和框移突變造成蛋白質氨基酸排列順序錄的DNA,使該區域的損傷盡快得以修復。

(三)重組修復

發生改變

(四)SOS修復

＞缺失：一個堿基或一段核甘酸鏈從DNA大分子上

消失。＞當DNA損傷廣泛難以繼續復制時，由此而誘發出

一系列復雜的反應。

＞插入原來沒有的一個堿基或一段核甘酸鏈插入到

A在E.coli,各種與修復有關的基因，組成一個稱為

DNA大分子中間。

＞缺失或插入都可導致框移突變。調節子(regulon)的網絡式調控系統。

＞這種修復特異性低，對堿基的識別、選擇能力差。

＞框移突變是指三聯體密碼的閱讀方式改變，造成蛋

通過修復，復制如能繼續，細胞是可存活的。

白質氨基酸排列頁序發生改變。SOS

(三)重組或重排常可引起遺傳、腫瘤等疾病然而DNA保留的錯誤較多，導致較廣泛、長期的

突變。

＞DNA分子內較大片段的交換，稱為重組或重排。

＞移位的DNA可以在新位點上顛倒方向反置(倒

第11章RNA的生物合成

位)，也可以在染色體之間發生交換重組。

在生物界，RNA合成有兩種方式：

＞一是DNA指導的RNA合成，也叫轉錄,此為生物

DNA損傷(突變)可能造成兩種結果：其一是導致復制或

體內的主要合成方式，也是本章介紹的主要內容。

轉錄障礙(如胸腺喀咤二聚體，DNA骨架中產生切口或斷

＞另一種是指導的合成(

裂)；其二是導致復制后基因突變(如胞喀碇自發脫氨基RNARNARNA-dependent

RNAsynthesis)，也叫RNA復制(RNAreplication),

轉變為尿喀碇),使DNA序列發生永久性改變。所以，

必須通過進化使細胞擁有靈敏的機制，以識別和修復這些由RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependentRNA

損傷，否則細胞無法維持正常代謝。polymerase)催化，常見于病毒，是逆轉錄病毒以

外的病毒在宿主細胞以病毒的單鏈為模

四、DNA損傷的修復有多種類型RNARNA

板合成的方式。

修復(repairing)是對已發生分子改變的補償措施使其回RNA

復為原有的天然狀態。轉錄(transcription)是生物體以DNA為模板合成

■修復的主要類型：RNA的過程。

＞錯配修復(mismatchrepair)

＞直接修復(directrepair)

＞光修復(lightrepairing)

＞切除修復(excisionrepairing)

A重組修復(recombinationrepairing)

5

三、聚合酶結合到的啟動子上起動轉錄

復制和轉錄的區別RNADNA

>轉錄是不連續、分區段進行的。

位制

>每一轉錄區段可視為一個轉錄單位，稱為操縱子

模板網般融均含制模板域轉求(不對稱的求)

雙料dNTPN7P(operon).操縱子包括若干個結構基因及其上游

侑DMA聚合修RNA聚合牌(RNA-pol)

(upstream)的調控序列。

產物子代雙域DNAmRNA.tRNA.rRNA

《年保留攵制)>調控序列中的啟動子是RNA聚合酶結合模板DNA

國對A-T,G-CA-U,T-A.G-C

的部位，也是控制轉錄的關鍵部位。原核生物以

■參與轉錄的物質：RNA聚合酶全酶結合到DNA的啟動子上而起動轉

>原料：NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)錄，其中由。亞基辨認啟動子，其他亞基相互配

4

>模板：DNA口。

>酶：RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)>對啟動子的研究，常采用一種巧妙的方法即RNA

>其他蛋白質因子聚合酶保護法。

第一節原核生物轉錄的模板和酶>-35區的一致性序列：TTGACA,是RNA-pol對轉

一、原核生物轉錄的模板錄起始的辨認位點。

>DNA分子上轉錄出RNA的區段，稱為結構基因>-10區的一致性序列：TATAAT,稱為Pribnow盒。

(structuralgene)。形成穩定的酶-DNA復合物，開始轉錄。

>轉錄的這種選擇性稱為不對稱轉錄(asymmetric第二節原核生物的轉錄過程

transcription),它有兩方面含義：在DNA分子雙一、轉錄起始需要RNA聚合酶全酶

鏈上，一股鏈用作模板指引轉錄另一股鏈不轉錄；■轉錄起始需解決兩個問題：

其二是模板鏈并非總是在同一單鏈上。>RNA聚合酶必須準確地結合在轉錄模板的起始區

>DNA雙鏈中按堿基配對規律能指引轉錄生成RNA域。

的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand),>DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉錄的模板。

作有意義鏈或Watson鏈。相對的另一股單鏈是編轉錄起始過程：

碼鏈(codingstrand),也稱為反義鏈或Crick鏈。>1.RNA聚合酶全酶位2印匕)與模板結合，形成閉

二、RNA合成由RNA聚合酶催化合轉錄復合體(closedtranscriptioncomplex);

(-)RNA聚合酶能直接啟動RNA鏈的合成>2.DNA雙鏈局部解開，形成開放轉錄復合體(open

>DNA依賴的RNA聚合酶催化合成RNA;transcriptioncomplex);

>RNA合成的化學機制與DNA依賴的DNA聚合酶催A3.在RNA聚合酶作用下發生第一次聚合反應,形

化DNA合成相似。成轉錄起始復合物：

聚合酶在啟動鏈延長時需要引物存在，

>DNADNA儂即七)-

而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動RNA鏈的RNApolDNA-pppGpN-OH3'

延長。A第一個磷酸二酯鍵生成后,O亞基即從轉錄起始復

合物上脫落，核心酶連同四磷酸二核苗酸，繼續結

>RNA聚合酶和DNA的特殊序列一一啟動子

合于模板上，酶沿鏈前移,進入延長階

(promoter)結合后,就能啟動RNA合成。DNADNA