植物的人工繁殖例子1:蘭花組織培養名貴蘭花——達摩蘭:以禪宗“一花開五葉,結果自然成”得詩意命名。在臺灣,早期達摩蘭量少,求種者多,非常昂貴;有人曾以一盆爪藝達摩交換臺中市一棟高樓。蘭花就是第一個組織培養成功產業化得植物。珍稀而名貴得達摩蘭等名貴蘭花,如今已成市井之花。一株不過百元。例子2:土豆:"第二面包","植物之王”,熱量低于谷類糧食,就是理想得減肥食物,和玉米、小麥、水稻、燕麥被稱為世界五大糧食作物。欣賞一個視頻:脫毒植物得培育問題:1、傳統途徑存在得問題？為什么要采用組織培養？2、什么就是組織培養？原理就是什么？3、優點與應用有哪些？本節主要內容1。組織培養再生植物2。人工種子本節重要問題1。細胞全能性、細胞分化與脫分化2。激素在細胞分化中得調節作用3。植物經組織培養得再生途徑一理論知識回顧——生殖、細胞全能性、細胞分化、脫分化1、有性生殖(Sexualreproduction):就是兩個配子融合為一,成為合子或受精卵,再發育成為新一代個體得生殖方式。2、無性生殖(Asexualreproduction):不涉及性別、沒有配子參與、沒有受精過程得生殖都屬于無性生殖(Asexualreproduction)。許多高等植物得營養器官(例如根、莖、葉等),在脫離母體后能發育成完整得植株,這種繁殖方式也稱為營養生殖。?3、細胞全能性(totipotency):就是指分化細胞保留著全部得核基因組,具有生物個體生長、發育所需要得全部遺傳信息,具有發育成完整個體得潛能。?細胞全能性學說:1902年,德國植物學家哈伯蘭德(Haberlandt)提出了細胞全能性學說,預言植物細胞具有全能性。?植物細胞全能性:細胞全能性首先在植物中被證實,1958年,史都華德(Steward)等利用胡蘿卜根韌皮部組織培養出了完整得新植株,證明高度分化得植物營養組織仍保持著發育成完整植株得能力,能以無性繁殖方式繁殖后代。?動物細胞全能性:動物細胞核移植實驗證明,胚胎細胞及高度分化得體細胞具有全能性。1997年克隆羊多莉得誕生為揭示動物細胞全能性做出了重大貢獻。?4、細胞分化(Differentiation):就是指細胞在形態、結構和功能上發生差異得過程,包括時間上和空間上得分化。?時間上得分化:就是指一個細胞在不同得發育階段可以形成不同得形態和功能;?空間上得分化:就是指同一種細胞由于所處得環境或部位不同可以形成不同得形態和功能。細胞分化能力得強弱稱為發育潛能。?形態發生(Morphogenesis):就是指通過細胞增殖、分化和行為塑造組織、器官和個體形態得過程。細胞分化與形態發生就是相互聯系在一起得。?細胞分化得實質:就是基因得差異表達(Differentialexpression),就是奢侈基因按照一定順序表達得結果。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點?奢侈基因(Luxurygene):又稱組織特異性基因(Tissue-specificgene),就是在各種組織中進行不同得選擇性表達得基因,與各類細胞得特殊性有直接關系。?持家基因(House-keepinggene):就是維持細胞得基本結構和最低限度功能所不可少得基因,例如:編碼組蛋白、核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等基因。這類基因在所有類型得細胞中都表達。?5、脫分化(Dedifferentiation):又稱去分化,就是指分化細胞失去特有得結構和功能變為具有未分化細胞特性得過程,即分化得細胞在適當條件下轉變為胚性狀態而重新獲得分裂能力得過程。?脫分化后得植物細胞經過細胞分裂,產生無組織結構、無明顯極性得松散得細胞團,稱之為愈傷組織(Callus)。?需要采用人工誘導技術誘導體細胞得脫分化。不同生物得細胞脫分化能力不同,決定了組織培養再生得難易。植物人工繁殖技術目地:為克服自然有性生殖得不足,滿足對優良植物得大量需求手段:通過無性繁殖技術實現植物快速繁殖。植物人工繁殖得方法:組織培養、人工種子、胚胎培養等一、植物組織培養再生植物植物組織培養(Planttissueculture)就是將植物器官、組織、細胞或原生質體等外植體材料無菌條件下培養在人工培養基上,在適當條件下誘發長成完整植株得一種技術。思考題:為什么植物組織培養能實現植物大規模繁殖？與傳統繁殖途徑得優點在哪里？(一)植物組織培養得優點?1、周期短,便于人工控制培養條件。繁殖速度快,經濟效益高。?2、占用空間小,不受地區、季節限制。?3、繁殖珍稀、瀕危苗木和突變體,就是優良品種培育得有效途徑。?4、利于保持原來品種得特性。(二)植物組織培養得應用1、無性系快速繁殖:例如一株蘭花一年可以繁殖到400萬株。2、種苗脫毒:可以有效地培育出大量得無病毒種苗。已經取得成功得有馬鈴薯、草莓、香蕉等。3、新品種選育

(1)

利用培養變異,篩選優良突變體。

植物離體培養,能夠明顯提高突變率,并且會有各種各樣得生理和形態突變,如株高、花色、植株形態、生育期、耐性等等?？梢詮闹羞x擇優良突變體,培育新品種。

(2)利用遠緣雜交幼胚培養,獲得雜種植株,克服其雜交不親和性。

有些植物遠緣雜交,能正常受精,但受精胚往往敗育。此種情況下,可以將幼胚在敗育前進行離體培養,以獲得緣遠雜種植株。

(3)利用細胞融合技術,克服遠緣雜交不親和性。

野生種往往有許多優良性狀,如抗干旱、抗病蟲害、耐澇、耐瘠薄、耐鹽堿、抗凍等特性。但大部分野生種與栽培種雜交不親和,嚴重影響了野生種優良遺傳基因得應用。利用細胞融合,可以克服這種雜交不親和性,獲得體細胞雜種,使野生種得利用成為可能。

(4)倍性育種4、離體種質保存

隨著地球不斷開發、生態環境破壞,種植資源日趨枯竭,大量有用基因損失。利用組織培養法,低溫保存(-196℃)或試管保存,為保存和搶救瀕臨滅絕得生物帶來希望。

5、在遺傳、生理生化和病理等研究上得應用。如光合作用、植物營養問題、植物抗病性等等。(三)植物組織培養技術1、生物條件外植體(Explant)主要指用于離體培養得植物或組織切段。因素:不同植物品種同一品種不同取材部位、發育階段。一般:生長點、幼嫩組織2、物理條件:培養環境、組織培養室無菌環境,人工控制溫度、光照、濕度等培養條件。需要一定得設備、器材和用具。?3、化學條件:培養基?(1)無機鹽?培養基中無機鹽得濃度通常在25mmol/L左右。?根據添加量多少分為大量元素(濃度大于0、5mmol/L)和微量元素(濃度低于0、5mmol/L)。?大量元素:主要有氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂。氮、硫、磷就是蛋白質、氨基酸、核酸和酶得主要成分。?微量元素:主要包括鐵、錳、銅、鋅、氯、硼、鉬等。這些微量元素對于蛋白或酶得生物活性十分重要,并參與生物過程得調節(2)有機物常用得有機物:糖類、氨基酸、維生素、醇類等。?糖類:就是離體培養得植物細胞所必需得,既可以作為碳源,又可以維持滲透壓。最常用得碳源就是蔗糖,葡萄糖和果糖也就是較好得碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養中也有應用。蔗糖使用濃度在2%—3%。?氨基酸:就是很好得有機氮源,可直接被細胞吸收利用。培養基中最常用得氨基酸就是甘氨酸,其她得如精氨酸、谷氨酸,谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白質水解產物(包括酪蛋白水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。?維生素:以各種輔酶得形式參與多種代謝活動,對生長、分化等有很好得促進作用。雖然大多數得植物細胞在培養中都能合成所必需得維生素,但在數量上不足,通常需加入一至數種維生素。常用得維生素包括:鹽酸硫胺素(Thiamine,VB1)、鹽酸吡哆醇Pyridoxin,VB6)、Vc(抗壞血酸)、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。VB1對愈傷組織得產生和生活力有重要作用,VB6能促進根得生長。Vc有防止組織變褐得作用。?肌醇:對糖類得相互轉化有促進作用。能促進愈傷組織得生長以及胚狀體和芽得形成。對組織和細胞得繁殖、分化有促進作用,對細胞壁得形成也有作用。?腺嘌呤:就是合成細胞分裂素得前體物質之一。添加腺嘌呤能促進細胞合成分裂素,有利于細胞得分裂和分化,促進芽得形成。植物激素(Phytohormone):就是植物自然狀態下產生得、對生長發育有顯著作用得微量有機物。能影響生長和分化。?在個體發育中,不論就是種子發芽、營養生長、繁殖器官形成以至整個成熟過程,主要由激素控制。?植物體內得激素與細胞內某種稱為激素受體得蛋白質結合后,影響DNA、RNA和蛋白質得合成,并對特殊酶得合成起調控作用,從而表現出調節代謝得功能。生長素(auxin)生長素就是由色氨酸通過一系列中間產物形成得。?在植物組織培養中,生長素主要用來刺激細胞分裂和誘導根得分化。?常用得生長素有:吲哚乙酸(IAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)等。IAA活力較弱。NAA起動能力要比IAA高出3-4倍。IBA就是促進發根能力較強得生長調節物質。NAA和IBA廣泛用于生根,并與細胞分裂素互作促進芽得增殖和生長。2,4-D起動能力比IAA高10倍,特別在促進愈傷組織得形成上活力最高,但她強烈抑制芽得形成。細胞分裂素(Cytokinin)?細胞分裂素大多就是嘌呤族衍生物,自然狀態下分裂素主要在根中形成,莖端、萌發中得種子、發育中得果實和種子也能合成分裂素。?分裂素得生理作用主要就是誘導芽得分化促進側芽萌發生長、促進細胞分裂與擴大。多用于誘導不定芽得分化和莖、苗得增殖,而在生根培養時使用較少或用量較低。?主要有激動素(KT)、6-芐基腺嘌呤(BA)和玉米素(ZT)等。其中最常用得就是6-芐基腺嘌呤。激素配比(4)培養基及分類幾種常用得培養基組分MSB5SHN6大量元素mg/Lmmol/Lmg/Lmmol/Lmg/Lmmol/Lmg/Lmmol/LNH4NO3KNO3CaCl2·2H2OMgSO4·7H2OKH2PO4NaH2PO4·H2O(NH4)2SO4KCl1650190044037017020、618、83、01、51、25250015025015013425001、12、025002004001257502546919、02830166185400463281752、946、6微量元素mg/Lμmol/Lmg/Lμmol/Lmg/Lμmol/Lmg/Lμmol/LKIH2BO3MnSO4·H2OZnSO4·7H2ONaMoO4·7H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2OFeSO4·7H2ONa2-EDTA0、836、215、68、60、250、0250、02527、837、35、010092、5301、001100100753、0102、0250、0250、02527、837、34、550607、0010、110010005、0101、00、250、0215206、080603、51、00、855550、81、63、31、527、837、34、82619、55、2100100蔗糖(g/L)30203050pH值5、75、55、85、8培養基得配制培養基母液得配制①大量元素母液:即就是含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素得無機鹽混合液。由于各組分得含量較高,一般配制成10倍濃度得母液。在使用時,每配制成1000mL培養液,吸取100mL母液。在配制母液時,要先將各個組分單獨溶解,然后按照一定得順序一邊攪拌,一邊混合,特別要注意將鈣離子(Ca++)與硫酸根、磷酸根離子錯開,以免生成硫酸鈣或磷酸鈣沉淀。②微量元素母液:即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素得無機鹽混合液。由于各組分得含量低,一般配制成100倍濃度得母液。在使用時,每配制1000mL培養液,吸取10mL母液。③鐵鹽母液:由于鐵離子與其她無機元素混在一起放置時,容易生成沉淀,所以鐵鹽必須單獨配制成鐵鹽母液。鐵鹽一般采用螯合鐵(Fe-EDTA)。通常配制成100倍(或者200倍)濃度得鐵鹽母液,在使用時,每配制1000mL培養液,吸取10mL(或者5mL)鐵鹽母液。④維生素母液:就是各種維生素和某些氨基酸得混合液。一般配制成100倍濃度得母液。在使用時,每配制1000mL培養液,吸取10mL母液。⑤植物激素母液:各種植物激素單獨配制成母液。一般濃度為100mg/L。使用時根據需要取用。由于大多數植物激素難溶于水,需要先溶于有機溶劑或者酸、堿溶液中,再加水定容到一定得濃度。她們得配制方法如下:2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)母液:稱取2,4-D10mg,加入2mL95%乙醇,稍加熱使之完全溶解,(或者用2mL1mol/L得NaOH溶解后)加蒸餾水定容至100mL。IAA(吲哚乙酸)母液:稱取IAA10mg,溶于2mL95%乙醇中,再用蒸餾水定容至100mL。IBA(吲哚丁酸),GA(赤霉酸)母液得配制方法與此相同。NAA(萘乙酸)母液:稱取NAA10mg,用2mL熱水溶解后,定容至100mL。KT(激動素)母液:稱取KT10mg,溶于2mL1mol/L得HCl中,用蒸餾水定容至100mL。BA(芐基腺嘌呤)母液得配制方法與此相同。玉米素母液:稱取玉米素10mg,溶于2mL95%得乙醇中,再加熱水定容至100mL。

4、植物組織培養得基本步驟(1)培養材料得采集植物具有全能性得細胞:受精卵;發育中得分生組織細胞;雌雄配子及單倍體細胞。用哪一部分器官最適于作為組培得材料來源:器官得生理狀態和年齡;取材季節、離體材料得大小、取得離體材料得植株質量等。快速繁殖:常用莖尖(長度0、5cm);脫毒苗:莖尖分生組織(長度小于0、1mm);(2)培養材料得消毒①先將材料用自來水洗干凈,最后一遍用蒸餾水沖洗,再用無菌紗布或吸水紙將材料上得水分吸干,并用消毒刀片切成小塊。②在無菌環境中將材料放入70%得酒精中浸泡30-60s。③再將材料移入漂白粉飽和液或0、1%升汞中消毒。④無菌水沖洗3~4次。常用得消毒劑:下表列出了目前常用得滅菌消毒劑。其使用濃度和處理時間,應根據外植體得情況及其對滅菌劑得敏感性而定。消毒劑使用濃度(%)去除消毒劑難易消毒時間(min)滅菌效果次氯酸鈉次氯酸鈣漂白粉升汞酒精過氧化氫溴水硝酸銀抗生素25~10飽和溶液0、1~170~7510~121~214~50mg/L易易易較難易最易易較難中5~305~305~302~100、2~25~152~105~3030~60很好很好很好最好好好很好好較好(3)制備外植體

接種時外植體得大小和形狀取決于實驗目得(莖、葉、根、花、果實、種子或其中某種組織切塊0、5cm,莖尖、胚、胚乳按組織單位切離)(4)接種和培養接種封口溫度和光照增殖:新梢形成后,繼代,把新梢分株或切段轉入增殖培養基中進行增殖。(5)根得誘導

生根就是獲得完整植株得一個關鍵。通過腋芽、不定芽、愈傷組織途徑產生得芽長成試管苗,必須誘導生根才能移植。

促使試管苗生根得方法通常有兩種:

1、在固體培養基上誘導生根:當試管苗長到2～3厘米高時,將她從基部切下,轉移到固體培養基上生根(生根培養基一般要求降低礦物營養得濃度,提高生長素得濃度,具體應根據植物不同而定)。

2、浸泡得方法:將切下得無根試管苗泡在含有高濃度生長素溶液中,生長素濃度為100毫克/升左右,浸泡時間從幾小時到1天,然后取出接種于不加任何激素得MS培養基上或者扦插在人工基質上,十天左右即可生根。

(6)煉苗和移栽

試管苗得生長環境

無菌異養弱光恒溫

蘆薈得植物組織培養過程

12345

6789

1011

5、植物組織培養再生植株得途徑以胡蘿卜為例器官發生途徑體細胞胚發生途徑體細胞胚(Somaticembryo)又叫胚狀體,就是指離體培養條件下沒有經過受精過程而形成得胚胎類似物。體細胞胚發生途徑:就是指體細胞在離體培養過程中經過了胚胎發育過程。體細胞胚起源于非合子細胞,因此不同于合子胚。(1)器官外植體直接發生途徑體細胞胚胎發生途徑1:葉片

誘導階段胚胎發育階段(蘭草,Chen等,1999)蘭草體細胞胚胎發生途徑2:愈傷組織誘導愈傷組織形成愈傷組織胚性化球形胚形成子葉胚期蝴蝶蘭,Lin等,2000體細胞胚胎發生途徑3:懸浮細胞愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養得胚性細胞團球形胚形成成熟子葉胚5、植物組織培養得問題分析參考:(4)品種限制植物組織培養參考圖片6、植物組織培養應用舉例種子萌發產生得原球莖胚培養產生得原球莖例子:寒蘭組織培養培養技術NAA(萘乙酸):生長素6-BA(6-芐基腺嘌呤):分裂素S-3307(優康唑):生長調節劑(促進分蘗、抑制細胞伸長,矮化植物)surose(蔗糖)體細胞胚再生途徑得應用:引言1、定義

人工種子得結構

農業生產中使用得天然種子,一般都就是由種皮、胚乳和胚三部分構成。目前研制得人工種子得結構:體細胞胚人工種皮人工胚乳

2、人工種子得優點3、關鍵技術問題(2)人工種皮制作(3)人工胚乳配制(4)包埋海藻酸鈉包埋示意圖(5)貯藏與發芽4、存在得問題物種主要結果胡蘿卜(Daucuscarota)有菌土壤中發芽成苗苜蓿(Med