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DB1302唐 山 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB1302/T397—2014實(shí)時(shí)熒光PCR2014-11-25發(fā)布 2014-12-25實(shí)施唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB1302/T397—2014DB1302/T397—2014前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由唐山市農(nóng)牧局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：張建民、張鑫、李愛軍、蒙君麗、張雅會(huì)、龐學(xué)良、周鑫、肖琎、張鶴鵬、趙福國。DB1302/T397—2014DB1302/T397—2014PAGEPAGE1動(dòng)物產(chǎn)品中動(dòng)物源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法范圍（源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法。（源性成分定性檢測。規(guī)范性引用文件GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法術(shù)語和定義、縮略語下列術(shù)語和定義、縮略語適用于本文件。術(shù)語和定義Ct每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。TaqMan寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，淬滅劑連接在探針的3’末端。豬源性成分豬種屬特異性DNA片段。牛源性成分牛種屬特異性DNA片段。羊源性成分羊種屬特異性DNA片段。兔源性成分兔種屬特異性DNA片段。馬源性成分馬種屬特異性DNA片段。驢源性成分驢種屬特異性DNA片段。雞源性成分雞種屬特異性DNA片段。鴨源性成分鴨種屬特異性DNA片段。鵝源性成分鵝種屬特異性DNA片段。狗源性成分狗種屬特異性DNA片段。貓?jiān)葱猿煞重埛N屬特異性DNA片段。鼠源性成分鼠種屬特異性DNA片段。貉源性成分貉種屬特異性DNA片段。縮略語DNA：脫氧核糖核甘酸PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCRDNA制備膜技術(shù)提取DNADNAPCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的強(qiáng)弱判定，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品中動(dòng)物源性成分的定性分析。材料與試劑設(shè)備和材料實(shí)時(shí)熒光PCR檢測系統(tǒng)高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000r/min以上）剪刀、鑷子（經(jīng)180℃±2℃，2h高溫滅菌）微量可調(diào)移液器及配套吸頭（10μL、200μL、1000μL）實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管離心管（1.5mL、2.0mL）紫外燈水浴鍋恒溫干燥箱超純水機(jī)分析天平：感量為0.00001g試劑除特別說明以外試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。無水乙醇（C2H6O）：優(yōu)級(jí)純基因組DNA提取試劑盒本試劑盒分試劑PartⅠ和PartⅡ兩部分。詳見表1，表2。表1 PartⅠ組成注：-20℃保存注：-20℃保存1mL0.5mL蛋白酶K（ProteinaseK，20mg/mL）核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）注：緩沖液GL若出現(xiàn)沉淀，于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。緩沖液WB在首次使用前，添加56mL的無水乙醇，混合均勻。試劑盒室溫（15℃-25℃）保存。12mL12mL28mL注：緩沖液GL若出現(xiàn)沉淀，于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。緩沖液WB在首次使用前，添加56mL的無水乙醇，混合均勻。試劑盒室溫（15℃-25℃）保存。12mL12mL28mL24mL14mL支支GL（BufferGL）GB（BufferGB）緩沖液WA（BufferWB（BufferWB）洗脫緩沖液（Elution離心柱（SpinColumns）收集管（ColletionTubes）動(dòng)物源性成分試劑盒豬、牛、羊、兔、馬、驢、雞、鴨、鵝、狗、貓、鼠、貉源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，-20℃保存。材料與試劑DNA取2mg～25mg2mL180μL的緩沖液GL20μL的蛋白酶K和10μL核糖核酸酶562～3GB和200μL無水乙醇，充分吸打混勻。將離心柱安置于收集管上，將上述制備溶液移至離心柱中，12000r/min離心2min，棄去濾液。將500μL緩沖液WA加入至離心柱中，12000r/min離心1min，棄去濾液。沿離心柱管壁四周加入700μL的緩沖液WB，12000r/min離心1min，棄去濾液。再沿離心柱管壁四周加入700μL的緩沖液WB，12000r/min離心1min，棄去濾液。將離心柱安置于收集管，12000r/min離心2min。將離心柱安置于1.5mL離心管中上，在離心柱膜中央處加入100μL65℃的洗脫緩沖液，室溫靜置5min，12000r/min離心2min洗脫DNA。以上操作均在樣品配置區(qū)進(jìn)行。動(dòng)物源性成分檢測擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系見表3PCR反應(yīng)管中各分裝18μL表3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系(20μL體系)試劑組成體積（μL）2×預(yù)混液10.0引物混合液4.0探針混合液2.0樣品DNA2.0ddH2O2.0注:陽性對(duì)照用相應(yīng)的組織DNA作為模板,陰性對(duì)照用不含相應(yīng)成分的樣品作為模板,空白對(duì)照用等體積ddH2O作為模板。加樣在各設(shè)定的PCR反應(yīng)管中分別加入制備好的2μL樣品DNA溶液,蓋緊蓋子,離心10s。以上操作均在PCR反應(yīng)配置區(qū)進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測將6.2.2中離心后的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR檢測系統(tǒng)內(nèi)，記錄樣品擺放順序。循環(huán)條1.6℃/s速度上升到95℃保持95℃下1.6℃/s速度下降到60℃保持45s，循環(huán)40次，在60℃收集熒光。檢測結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定結(jié)果。以上操作均在擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行。結(jié)果判定結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。結(jié)果判定與表述結(jié)果判定空白對(duì)照：無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，或Ct值＞40。陰性對(duì)照：無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，或Ct值＞40。陽性對(duì)照：有典型的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，Ct值≤35。結(jié)果表述樣品：有典型的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，Ct值≤35，結(jié)果陳述為“檢出豬源性成分”