ICS65.120CCSB46中華人民共和國國家標準GB/T45200—2025飼料中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的測定高效液相色譜法Determinationofneohesperidindihydrochalconeinfeeds—Highperformanceliquidchromatography2025-01-24發布2025-08-01實施國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會發布/GBT45200—2025前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國飼料工業標準化技術委員會(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位:山東省畜產品質量安全中心、山東奔月生物科技股份有限公司、成都大帝漢克生物科技有限公司。本文件主要起草人:張瑋、王振東、王英英、杜寧、張蕓、布巖林、孫延軍、閆傳琦、劉婕、楊智國、李俊玲、趙學峰、李會榮、張坤、崔立軍、余淼、鄧蘋玲、鄧虹。Ⅰ/GBT45200—2025飼料中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的測定高效液相色譜法范圍1本文件描述了飼料中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的高效液相色譜測定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、復合預混合飼料中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的測定。本文件方法在配合飼料、濃縮飼料、精料補充料的檢出限為0.5mgkg/,定量限為5.0mgkg/。/,定量限為1.0mg/kg;復合預混合飼料的檢出限為2.5mgkg規范性引用文件2下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682GB/T20195分析實驗室用水規格和試驗方法動物飼料試樣的制備術語和定義34本文件沒有需要界定的術語和定義。原理試樣中的新甲基橙皮苷二氫查耳酮用甲醇甲酸乙腈溶液提取,經固相萃取柱凈化后,高效液相色-譜儀測定,外標法定量。試劑或材料5除非另有規定,僅使用分析純試劑。水:GB/T6682,一級。5.15.25.35.45.55.65.75.8甲醇:色譜純。甲酸:色譜純。乙腈:色譜純。甲醇溶液(90%,體積分數):量取甲醇(5.290)mL,用水稀釋至100mL,混勻。甲酸乙腈溶液(2%,體積分數):移取甲酸(5.32.)0mL,用乙腈(5.4)稀釋至100mL,混勻。提取液:量取甲醇(5.2400mL)、甲酸乙腈溶液(5.6100)mL,混勻。甲酸溶液(0.1%,體積分數):移取甲酸(5.31.)0mL,用水稀釋至1000mL,混勻。5.9標準儲備溶液(1mgmL/):準確稱取新甲基橙皮苷二氫查耳酮標準品(C28H36O15,CAS號:20702-1/GBT45200—202577-6,純度≥98.0%10mg)(精確至0.01mg)于10mL容量瓶中,用甲醇(5.2)溶解并定容,混勻,-18℃以下保存,有效期6個月。容量瓶中,用甲醇(5.2)5.10稀釋定容,混勻,-18℃以下保存,有效期1個月。標準系列溶液:分別準確移取適量標準中間溶液(5.10)于容量瓶中,用甲醇溶液(5.5)稀釋定5.91mL于10mL標準中間溶液(/):準確移取標準儲備溶液()100gmLμ5.11容,配制成質量濃度分別為/、/、/、/、/和/0.5gmL1gmL5gmL10gmL20gmL50gmL標準系μμμμμμ列溶液。臨用現配。固相萃取柱:填料為N-丙基乙二胺、三官能十八烷基、合成石墨化炭黑,598mg6mL/,或性能相5.12當者。5.13微孔濾膜:0.45μm,有機系。儀器設備6高效液相色譜儀:配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。6.16.2分析天平:精度分別為0.1mg0.、01mg。渦旋振蕩器。6.36.46.56.66.7氮吹儀:帶加熱裝置,控溫精度±2℃。離心機:轉速不低于5000rmin/。固相萃取裝置。渦旋混合器。樣品7按照GBT20195/制備試樣。取樣品至少200g,粉碎使其全部通過0.425mm孔徑的分析篩,充分混勻,裝入密閉容器中,備用。試驗步驟8提取8.1平行做2份試驗。稱取試樣2.5g(精確至0.1mg)于50mL離心管中,準確加入提取液(5.7)10mL,渦旋混勻,振蕩提取,/離心,上清液備用。20min5000rmin5min凈化8.2準確移取配合飼料、濃縮飼料、精料補充料上清液(8.14mL)過固相萃取柱(5.12),流速小于1mLmin/,收集流出液,再加入3mL甲醇(5.2)過柱,抽干,收集所有流出液,混勻后用40℃氮氣吹干,準確加入1mL甲醇溶液(5.5)溶解殘留物,渦旋混勻,過微孔濾膜(5.13),待測。準確移取復合預混合飼料上清液(8.14mL)過固相萃取柱(5.12),流速小于1mLmin/,收集流出液,再加入3mL甲醇(5.2)過柱,抽干,將所有流出液收集至10mL容量瓶中,用甲醇(5.2)定容,混勻,過微孔濾膜(5.13),待測。測定8.3液相色譜參考條件8.3.1液相色譜參考條件如下:2/GBT45200—2025a)色譜柱:C18色譜柱,長250mm,內徑4.6mm,粒度,或性能相當者;5mμb)流動相:A相為乙腈(5.4),B相為0.1%甲酸溶液(5.8),梯度洗脫程序見表1;c)流速:1.0mLmin/;d)柱溫:35℃;)進樣量:;e10Lμf)檢測波長:281nm。表1梯度洗脫程序時間A相B相min%%0.00.520204060602020808060404080809.09.511.512.016.0標準系列溶液和試樣溶液測定8.3.2在儀器的最佳條件下,分別取標準系列溶液(5.11)和試樣溶液(8.2)上機測定。新甲基橙皮苷二氫查耳酮標準溶液的液相色譜圖見附錄A。定性8.3.3以保留時間定性,試樣溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的保留時間應與質量濃度相當標準系列溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的保留時間一致,其相對偏差在±2.5%之內。定量8.3.4以新甲基橙皮苷二氫查耳酮的質量濃度為橫坐標,以色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,其相關系數應不低于0.99。試樣溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的質量濃度應在標準曲線的線性范圍內,若超出線性范圍,應將試樣溶液用甲醇(5.2)稀釋后重新測定。單點校準定量時,試樣溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的質量濃度與標準溶液質量濃度相差不超過30%。試驗數據處理9試樣中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的含量以質量分數w計,數值以毫克每千克(mgkg/)表示。多點校準按式()1計算,單點校準按式()2計算。w=ρ×V1×V3×f×1000m×V×1000…………(1)2式中:———試樣中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的含量,單位為毫克每千克(mg/kg);wρ———由標準曲線查得的試樣溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的質量濃度,單位為微克每毫升3/GBT45200—2025(μg/mL);———試樣提取溶液的總體積,單位為毫升(mL);———試樣溶液最終體積,單位為毫升(mL———超出標準曲線范圍后的稀釋倍數;V1V3f);1000———換算系數;———試樣質量,單位為克();gm———凈化時所用試樣提取溶液的體積,單位為毫升(mL)。V2w=A×ρs×V1×V3×f×1000…………(2)As×m×V2×1000式中:———試樣中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的含量,單位為毫克每千克(mgkg/);w———試樣溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的峰面積;A———標準溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的質量濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);———試樣提取溶液的總體積,單位為毫升(mL);ρsV1———試樣溶液最終體積,單位為毫升(mL);V3f———超出標準曲線范圍后的稀釋倍數;1000———換算系數;———標準溶液中新甲基橙皮苷二氫查耳酮的峰面積;Asm———試樣質量,單位為克();g———凈化時所用試樣提取溶液的體積,單位為毫升(mL)。V2測定結果