動物細胞工程發展歷程希普：首例胚胎移植成功哈里森:首創動物組織體外培養法張明覺：發現哺乳動物精子獲能現象格登、童第周：體細胞核移植成功試管家兔誕生米爾斯坦和科勒：創立單克隆抗體技術胚胎分割移植成功埃文斯：成功分離和培養小鼠的胚胎干細胞克隆羊多莉誕生山中伸彌：獲得誘導多能干細胞單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生我國科學家首次培育了體細胞克隆猴。1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年

Animalcellengineering00動物細胞工程動物細胞培養動物細胞融合動物細胞核移植——動物細胞工程的基礎一、動物細胞培養動物細胞培養是指從動物體中取出相關的

，將它們分散成

，然后在

下，讓這些細胞

和

的技術。生長組織單個細胞適宜的培養條件增殖

1.定義：

Animalcellculture00動物細胞培養動物體組織單個細胞細胞生長和增殖取出分散適宜條件（1）相關組織：

一般是指動物胚胎或幼齡動物的組織，

因為這些組織或細胞的生命力旺盛，分化程度低，分裂能力強，容易培養。（2）適宜的培養條件：

不同的細胞、組織適合生存的環境不同，需要配置不同的培養基。——充足的營養、穩定的內環境2.原理：細胞增殖3.目的：獲得細胞或細胞產物

Animalcellculture00動物細胞培養

動物細胞培養時，需將相關的組織分散成單個細胞培養，因為將組織塊分散成單個細胞后，細胞所需的營養容易供應，其代謝廢物容易排出；而且用大塊組織進行培養時，組織塊內部細胞的營養供應和代謝廢物排出都比較困難，且細胞相互接觸，限制了細胞的生長和增殖。同時，分散成單個細胞培養，也可使在細胞水平上操作的其他技術得以實現。將組織分散成單個細胞培養的原因動物細胞培養需要哪些基本條件？動物細胞培養的基本操作過程是什么？怎樣客觀分析干細胞在臨床上的應用所產生的效益與風險？動物細胞培養

Fromsociety00從社會中來在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產生免疫排斥反應。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細胞培養出可供移植的皮膚？可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進行培養、擴增。目前，科學家還在研究對皮膚干細胞進行培養，以獲得適合臨床上使用的人造皮膚。CONTENTS目錄動物細胞培養的條件Conditionsofanimalcellculture01動物細胞培養的過程Theprocessofanimalcellculture02干細胞培養及其應用Stemcellcultureanditsapplication03習題鞏固Exercisestoconsolidate04動物細胞培養的條件ConditionsofanimalcellculturePART01

Conditionsofanimalcellculture01動物細胞培養的條件動物細胞培養的條件營養物質其他條件<<糖類、氨基酸無機鹽、維生素……無菌、無毒的環境適宜溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環境

Conditionsofanimalcellculture01動物細胞培養的條件1.營養合成培養基+①合成培養基：

將細胞所需的營養物質按種類和所需量嚴格配制而成的培養基稱為合成培養基。②血清等一些天然成分：

由于人們對細胞所需的營養物質尚未全部研究清楚。血清可以補充合成培養基中缺乏的物質，如蛋白質、氨基酸、未知的促生長因子等。細胞培養時，一般需添加10%～20%的血清或血漿。一般使用液體培養基，也稱為培養液。血清等一些天然成分Whyserumisusuallyaddedtoanimalcellculture01動物細胞培養通常要添加血清的原因

血清中含有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白質主要為白蛋白和球蛋白；氨基酸有多種，是細胞合成蛋白質的基本原料，且有些氨基酸是動物細胞本身不能合成的（稱為必需氨基酸），必須由培養液提供；激素有胰島素、生長激素等。血清還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質，它們能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，在培養動物細胞時，為保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需在培養基中添加10%~20％的血清等天然成分。

Conditionsofanimalcellculture01動物細胞培養的條件2.無菌、無毒的環境①對培養液和所有培養用具進行滅菌處理②在無菌環境下進行操作③可根據實際情況適量添加抗生素無菌

清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。無毒④定期更換培養液和

Conditionsofanimalcellculture01動物細胞培養的條件3.溫度、pH和滲透壓一般與動物體內相同①適宜的溫度：②適宜的pH：多數動物細胞生存的適宜pH為

。③適宜的滲透壓：維持細胞正常的形態和功能。4.氣體環境①氣體的組成及作用95%空氣5%CO2②培養裝置:哺乳動物細胞培養的溫度多以

為宜。36.5±0.5℃培養皿或松蓋培養瓶CO2培養箱置于維持培養液的pH細胞代謝所必需動物細胞培養的過程TheprocessofanimalcellculturePART0202動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture體外培養的動物細胞可以分為兩大類：懸浮培養瓶第1類：懸浮生長細胞細胞能夠懸浮在培養液中生長增殖第2類：貼壁生長細胞細胞需要貼附于某些基質(如培養瓶壁)表面才能增殖(主要類型)這些細胞往往貼附在培養瓶的瓶壁上，這種現象稱為細胞貼壁。接觸抑制當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖。02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture思考：“細胞增殖到互相接觸的時候，糖蛋白識別了這種信息，就會使細胞停止繼續繁殖，出現接觸抑制的現象”試結合上述解釋，舉例說明哪種細胞無接觸抑制現象，并闡述原因。癌細胞；癌細胞的細胞膜上糖蛋白等物質減少02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture傳代培養取動物組織制成細胞懸液原代培養放入CO2培養箱中培養放入CO2培養箱中培養用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法，將組織分散成單個細胞轉入培養液中進行02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture機械方法胰蛋白酶處理膠原蛋白酶處理動物組織塊分散成單個細胞加培養液細胞懸液原代培養放入培養瓶在適宜條件在適宜條件分瓶培養傳代培養1.取材：2.原因:細胞分化程度低，增殖能力強，容易培養。動物胚胎或幼齡動物的組織、器官。（一）取動物組織：02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture機械方法胰蛋白酶處理膠原蛋白酶處理動物組織塊分散成單個細胞加培養液細胞懸液原代培養放入培養瓶在適宜條件適宜條件分瓶培養傳代培養（二）取動物組織：1.將組織分散成單個細胞原因:a.從動物體取出的成塊組織中，細胞與細胞靠在

一起，彼此限制了生長和增殖；b.能使細胞與培養液充分接觸，更易進行物質交換。保證細胞

所需的營養物質的供應及有害產物的及時排出。02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture①常用胰蛋白酶分散細胞，這說明細胞間的物質主要是什么成分？

用胃蛋白酶行嗎？說明細胞間的物質主要是蛋白質。

胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當pH大于6時，胃蛋白酶就失去活性，多數動物細胞培養的適宜pH為7.2~7.4，胃蛋白酶在此環境中沒有活性，所以用胃蛋白酶不行。②胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎，為什么？細胞膜的成分中含有蛋白質，而胰蛋白酶能夠水解蛋白質，因此，胰蛋白酶會把細胞消化掉。因此，胰蛋白酶處理的時間不能太長。02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture機械方法胰蛋白酶處理膠原蛋白酶處理動物組織塊分散成單個細胞加培養液細胞懸液原代培養放入培養瓶在適宜條件傳代培養適宜條件分瓶培養2.用培養液將細胞制成細胞懸液，再將

細胞懸液放入培養皿或培養瓶。①原代培養將分瓶之前的細胞培養，即動物組織經過處理后的初次培養稱為原代培養。②傳代培養將分瓶后的細胞培養稱為傳代培養。培養瓶或培養皿要求：內表面光滑、無毒、易于貼附。02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture機械方法胰蛋白酶處理膠原蛋白酶處理動物組織塊分散成單個細胞加培養液細胞懸液原代培養放入培養瓶在適宜條件傳代培養適宜條件分瓶培養懸浮生長貼壁生長(大多數）細胞密度過大有害代謝物積累培養中營養物質缺乏接觸抑制細胞分裂受阻需要02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture進行傳代培養(分瓶培養)時，如何處理？懸浮細胞貼壁細胞離心法收集胰蛋白酶處理制成細胞懸液分瓶培養02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture

區分兩種“培養”的關鍵是看用胰蛋白酶處理的對象。思考：正常細胞能否一直傳代培養下去？①第一次：用胰蛋白酶對剪碎的動物組織進行處理，使其分散

成單個細胞后進行培養，為原代培養。②第二次：細胞培養過程中出現接觸抑制，用胰蛋白酶使其從

瓶壁上脫離下來，然后，將其分散到多個培養瓶中繼續培養，

為傳代培養。02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture傳代培養部分細胞的細胞核型可能會發生變化，增殖緩慢，甚至完全停止大部分細胞衰老死亡少數細胞會克服細胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細胞已經發生了突變，正朝癌細胞發展10~50代繼續培養（50代以后）（有限細胞系）（無限細胞系）使用或保存的細胞通常為10代以內，以保持細胞正常的二倍體核型(遺傳物質不改變)。這一階段的細胞稱為細胞株細胞系的遺傳物質一定改變02有關動物細胞培養的問題

Questionsaboutanimalcellculture1.幼齡動物的細胞與老齡動物的細胞比較，分化程度低的細胞

與分化程度高的細胞比較，哪些細胞更容易培養？為什么？細胞增殖能力與供體的年齡有關，幼齡動物的細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物的細胞則相反。所以，一般來說，幼齡動物細胞比老齡動物細胞易于培養。分化程度越低的細胞，增殖能力越強，所以更容易培養。2.動物細胞培養能否像植物組織培養那樣最終培養成新個體？不能，動物細胞培養只能使細胞數目增多，不能發育成新的動物個體。02植物組織培養與動物細胞培養比較

Comparisonbetweenplanttissuecultureandanimalcellculture比較項目植物組織培養動物細胞培養原理培養基性質培養基特有成分培養過程培養結果培養目的植物細胞的全能性細胞增殖固體液體植物激素動物血清脫分化、再分化原代培養、傳代培養植物體動物細胞群快速繁殖植物得到動物細胞及細胞產物相同點：培養基中都需要加入營養物質、培養過程中都需要防止雜菌污染、都需要提供適宜的溫度、pH和滲透壓的條件。02動物細胞培養的過程

Theprocessofanimalcellculture機械方法胰蛋白酶處理膠原蛋白酶處理動物組織塊分散成單個細胞加培養液細胞懸液原代培養放入培養瓶在適宜條件傳代培養適宜條件分瓶培養懸浮生長貼壁生長(大多數）細胞密度過大、有害代謝物積累、營養物質缺乏等細胞貼壁、接觸抑制細胞分裂受阻②制成細胞懸液，分瓶培養①收集細胞懸浮培養的細胞:直接用離心法收集貼壁細胞:用胰蛋白酶處理分散成單個細胞，用離心法收集干細胞培養及其應用StemcellcultureanditsapplicationPART03發現最早、研究最多的、應用最成熟的實例03干細胞培養及其應用——干細胞

Stemcellcultureanditsapplication——Stemcell干細胞早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中動物和人體內保留的具有分裂和分化能力的細胞。胚胎干細胞成體干細胞誘導多能干細胞定義分布種類發現最早、研究最多的、應用最成熟的實例03干細胞培養及其應用——胚胎干細胞（ES細胞）

Stemcellcultureanditsapplication——Embryonicstemcell胚胎干細胞早期胚胎中需要分化誘導因子誘導分布特點應用實例具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能在體外分化成心肌細胞、神經元細胞和造血干細胞等（4）局限性必須從胚胎中獲取，涉及倫理問題；因而限制了在醫學上的應用。發現最早、研究最多的、應用最成熟的實例03干細胞培養及其應用——成體干細胞

Stemcellcultureanditsapplication——Adultstemcell成體干細胞成體組織或器官內造血干細胞（骨髓、外周血和臍帶血中）神經干細胞（神經系統中）精原干細胞（睪丸中）具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發育成完整個體的能力發現最早、研究最多的、應用最成熟的實例分布舉例特點有著自我更新能力及分化潛能的干細胞，與組織、器官的發育、再生和修復等密切相關。（3）應用1.應用原理：03干細胞培養及其應用——成體干細胞

Stemcellcultureanditsapplication——Adultstemcell2.應用實例：治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）。治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病。①造血干細胞：②神經干細胞：

干細胞將在再生醫學、藥物安全性與有效性檢測等領域發揮大作用。3.面臨的問題：存在導致腫瘤發生的風險4.應用展望：治療細胞損傷造成的疾病發現最早、研究最多的、應用最成熟的實例03干細胞培養及其應用——誘導多能干細胞（iPS細胞）

Stemcellcultureanditsapplication——Inducedpluripotentstemcells誘導多能干細胞通過體外誘導小鼠成纖維細胞得到的類似胚胎干細胞的一種細胞①將特定基因或特定蛋白導入細胞

（成纖維細胞、已分化的T細胞、B細胞）②用小分子化合物誘導形成①誘導過程無須破壞胚胎；②iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內后，理論上可以避免免疫排斥反應。概念制備方法優點03（3）應用移植取成纖維細胞等iPS細胞轉入相關因子細胞發生轉化分化胰島細胞神經元血細胞腸上皮細胞心肌細胞肝細胞病人iPS細胞用于治療人類疾病示意圖干細胞培養及其應用——誘導多能干細胞（iPS細胞）

Stemcellcultureanditsapplication——Inducedpluripotentstemcells取成纖維細胞轉入相關因子細胞轉化為iPS細胞誘導iPS細胞定向分化為多種組織細胞移植回病人體內03干細胞培養及其應用

Stemcellcultureanditsapplication類型應用造血干細胞神經干細胞誘導多能干細胞（iPS細胞）治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）可治療小鼠的鐮狀細胞貧血癥，在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展干細胞應用面臨的問題存在存在著導致腫瘤發生的風險。無菌、無毒營養溫度、pH和滲透壓氣體環境制備細胞懸液原代培養傳代培養動物細胞培養動物細胞培養的條件動物細胞培養的過程干細胞的培養和應用干細胞的種類、特點及應用iPS細胞的培養和應用課堂小結習題鞏固ExercisestoconsolidatePART0404習題鞏固

Exercisestoconsolidate1.判斷下列有關動物細胞培養的表述是否正確。（1）培養環境中需要O2，不需要CO2。（

）（2）細胞要經過脫分化形成愈傷組織。（

）（3）培養液中