DB35Diagnostictechniqueforduckadenovirus3infect福建省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 1 3 4 6 7本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研1鴨3型腺病毒病診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨3型腺病毒病的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷和DAdV-3：鴨3型腺病毒（DuckAdenovirus3）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactPBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferTris：三羥甲基氨基甲烷（TrihydroxymethylAmin腺病毒科（Adenoviridae）下設(shè)5個屬，分別為富AT腺病毒屬（Atadenovirus）、禽腺病毒屬（Aviadenovirus）、魚腺病毒屬（Ichtadenovirus）、哺乳動物腺病毒屬（Mastadenovirus）和唾液4.1剖檢病變4.2初步診斷5.1主要儀器設(shè)備2）；e)酚-三氯甲烷-異戊醇（25:24:1）；）；上游引物DAdV-3F：5,-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3,。下游引物DAdV-3R：5,-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3,。），），3可采用市售商品化的等效核酸DNA提取試劑盒，按照說明書完成核5.5對照5.6.2也可采用市售商品化的等效PCR預(yù)混液檢測試劑盒，并按照市售商品PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，PCR反應(yīng)管在電泳鑒定前可置于2℃~8℃冰箱保存。分別取5μLPCR擴(kuò)增（配置方法按照附錄A中A.6的規(guī)定）板的加樣孔中，加上DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)5μL，以5V/cm的電壓進(jìn)行電泳，30min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。當(dāng)陽性對照出現(xiàn)約548bp的特異性條帶（參見附錄B圖B.1中1號泳道）、陰性對照見附錄B圖B.1中2號泳道空白對照無擴(kuò)增條帶（參見附錄B圖B.1中3號泳道當(dāng)待檢樣品出現(xiàn)約548bp條帶（參見附錄B圖B.1中4號泳道可判定為陽性；當(dāng)待檢樣品無性擴(kuò)增條帶（參見附錄B圖B.1中5號泳道）判為陰性。必要時，將目的條帶進(jìn)行膠回收后克隆測序，待測樣品的測序結(jié)果和參考序列（參見附錄C）進(jìn)行核苷酸同源性4試劑的配制A.110%十二烷基硫酸鈉將10g十二烷基硫酸鈉溶于80mL滅菌雙蒸水中，調(diào)節(jié)溶液的pHA.2蛋白酶K（10mg/mL）A.375%乙醇取無水乙醇750mL加入滅菌雙蒸水250mL，定容至1000mL，-Na2HPO4·12H2O2.9gKH2PO4將上述試劑溶于800mL滅菌雙蒸水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高壓滅菌30min，4℃保置微波爐中加熱至完全融化，待冷至50℃~60℃時，加溴化乙錠溶液（配制方法按照A.8的規(guī)5A.71×TAE電泳緩沖液A.8溴化乙錠溶液A.950×TAE電泳緩沖液6）；7 ACACTAGACAACGGAGGCCTCGACCTCAAGGTGGACCCAGGAAGCCTGGCCGTCACTGACAATACCCTACACCTCACAAGCTCATACTCAACCTATGTCTTTACGAGTGGATCTGACACACTTCAGAAGACACAAGCCCAAGTGTGCTGCGGAGCAGGGTCTGTTACGTTTCCGTGCGCATACTATGCCAAGATCGTATGCTCAAACAATGTGTCTTCAGGATATATAACACTGAAGGTGAGCGCTGAGGATGCATCACATGCTGTAGATCAACGCTTCGCGACTATTCAACCAGTATTCACATTCTGGTTATGTCGAGACATAGGTAATGAAAACACCGTCAATTTTTCCCACTGTACCAACAACAGTTATAAGCCAGAGGAAACCGCAGTCGTTAAGGCATGCATCACACCAGCATACAAAAATTTTGATGTCAGCAATGTT