35DB35/T2024—2021鰻鱺皰疹病毒感染診斷技術(shù)規(guī)范ProtocolofdiagnosistechnologyforHerpesvirusanguillaeinfection2021-11-23發(fā)布2022-02-23實(shí)施福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 4 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草1GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrithyDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribondNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetePCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerasTaq酶：DNA聚合酶（ThermusAquatiTBE：三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（TTris：三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxym25.3dNTP：dCTP、dGTP、dATP、在鰻鱺的鰓、肝臟、脾臟、腎臟等部位及體表黏液，共取50mg～100mg樣品，置于1.5mL離心管后加入1.5倍體積的異丙醇，混勻后，靜置5min，12000g離心10min，棄上清液；加入600μL75%3乙醇，混勻后12000g離心10min，棄上清液，室溫靜置5在0.2mL離心管中加入10×PCR緩沖液（見(jiàn)附錄A的A.7）2.5μL、25mmol/L氯化鎂（MgCl2見(jiàn)附錄A的A.6）1μL、dNTP2μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶2U、1μL待測(cè)樣品DNA為模板，補(bǔ)充水反應(yīng)液混勻后，離心使其集中在離心管底部，將離心管置于PCR擴(kuò)增儀，按照94℃4min；再用TBE電泳緩沖液（見(jiàn)附錄A的A.4）配制1%的瓊脂糖[含0.5μg/mLEB（見(jiàn)附錄A的A平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面。取6μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2μL電泳上樣緩沖液（見(jiàn)附錄A的A.8）混勻，加入樣品孔，5V/cm電泳約30min，當(dāng)溴酚藍(lán)4按2%CTAB，1.4mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，20mmol/LTris-HClpH7.5配制。使A.4.1成分A.4.2制法A.7.1成分5A.7.2制法每100mL溶液中含溴酚藍(lán)0.256CATGCCGGGAGTCTTTTTGATCACGTCCTCCACTATAAGGATCTTTTGTCGCCCCGAGAGCGTGGTCAACATCTCCGATACGCCGTAGTGCGAGTTGGCGCAGATCTTCATCTCGTTCTGCAGCTGGTTGAAGTATTTTTTCAGTCCGGCTTCATGTCGCCCTTGTATTTGTTTCGCATGCTCAGGTAGTGGCGGAGGCTGGAAGACGTGTACGTCGTAAACCTGCCACACTCTTGTGTAGGAGGATGGTGTAGAG