35FluorescencequantitativePCRdiagnosisoffowlhydropercardium-hepatitisI 2 2 3 3 3 4 5 6本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件本文件起草單位：福建省農業科學院畜牧獸醫研究所、福州海關1禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量PCR診斷技術本文件適用于禽心包積液-肝炎綜合征的分子生物學診斷及流禽腺病毒4型fowladenov熒光定量PCR反應中每個反應管內的熒光信號達到設定的4疫病概述有很強的致病性。2010年以來，我國多地發生了HHS，并從發病雞群中分離到FAdV-4。該病主要臨床特蛋雞偶有發生，有報道鴨、鵝、鴿及野鳥也可發生該病。發病雞在4d后開始死亡，死亡期可持續7d~25.1.1臺式冷凍高速離心機（轉速5.1.3微量可調移液器（量程分別為100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL~5.2材料和試劑）：5.2.7蛋白酶K、Tris飽和苯酚、酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）、無水乙醇5.2.11陰性對照：Nuclease-freeWate樣品采集后應保存在2℃~8℃條件下，24h內送達實驗室。超過24h的應保存在-20℃條件下，且時間不應超過7d。如需長期保存，須保存在-70℃~-80℃條件下。取出棉拭子樣品，于旋渦混合儀上振蕩15s，4℃、5000r/min離心10min，取3取組織樣品，按質量體積比（1:5）加入組織稀釋液進行勻漿，轉入1.5mL無菌離心管中，反復凍7.1.3離心后吸取上清液轉移至1.5mL無菌離心管（注意不要吸出），），在PCR反應管中分別加入以下試劑：ProbeqPCRmix10μL，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4μL，40個循環；最后保存于4℃。同時，設立陽性對照和陰性對照各至少一9結果判定待檢樣品Ct值≤32時，且出現典型的擴增曲線，判為FAdV-4核酸檢測陽性，見附錄B待檢樣品Ct值＞35時，或無典型的擴增曲線，判為FAdV-4核酸檢測陰性，見4必要時可對定量PCR產物進行測序，參考序列5A.1棉拭子稀釋液和制霉菌素（5000IU/mL調節pH至7.2～7.4。A.2組織稀釋液和制霉菌素（1000IU/mL調節pH至7.2～7.4。稱量10g十二烷基硫酸鈉，加入90mL滅菌雙蒸水，小心攪拌A.575%乙醇量取750mL的無水乙醇加入250mL的a)正向引物FAdV-4-F：5,-CCCGATb)反向引物FAdV-4-R：5,-TGCTAAACTc)探針引物FAdV-4-P：5,-FAM-AACG熒光定量PCR擴增片段為196bp，引物和探針用雙蒸水溶解至10μmol/L6以建立的熒光定量PCR診斷技術對2份陽性樣品和2份N---陰性對照；選擇FAdV-4GDMZ株（GenBank的登錄號：MG856954）Hexon基因序列作為參考基因序列：cccgatctcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactacc