蛹蟲草中噴司他丁的測定液相色譜法范圍本標準規定了測定蛹蟲草中噴司他丁的液相色譜法。本標準適用于蛹蟲草子實體、菌絲體（干品）中噴司他丁的測定。本方法檢出限為1mg/kg。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T12728食用菌術語術語和定義下列術語和定義適用于本文件。噴司他丁PentostatinCAS號53910-25-1，分子式C11H16N4O4，分子量為258.27，結構式見圖1。噴司他丁于1974年由Warner-Lambert公司從抗生鏈霉菌的發酵液中分離出來的一種天然的核苷類抗生素，對腺苷脫氨酶具有極強的抑制效果，在臨床治療惡性腫瘤方面有廣泛應用。但因其生產成本高、市售價格較為昂貴，目前難以滿足需求。2018年中國科學院上海植物生理生態研究所王成樹研究團隊首次發現，蛹蟲草能夠高水平的合成具有抗癌活性的噴司他丁，這一發現為蛹蟲草的抗癌活性提供了充分的分子證明。圖1噴司他丁結構式原理試樣經超純水提取、定容、離心后，取上清液過濾膜，經C18高效液相色譜柱分離，依據保留時間定性，用外標峰面積定量。試劑和材料除非另有規定，所有試劑均為分析純，實驗室用水符合GB/T6682中規定的三級水要求，色譜用水符合GB/T6682中規定的一級水要求。除非另有規定，所有試劑均為分析純，實驗室用水符合GB/T6682中規定的三級水要求，色譜用水符合GB/T6682中規定的一級水要求。5.1噴司他丁標準品（CAS：53910-25-1）:純度≥98%。5.22.5g/L乙酸銨：甲醇：乙腈（96:2:2）：2.5g乙酸銨定容至1000mL超純水，混勻，過0.22μm濾膜（5.5）。5.3噴司他丁標準儲備溶液：精確稱量5.0mg噴司他丁標準品（5.2），用超純水溶解并定容至50mL，使用前配制。5.4噴司他丁標準工作溶液：分別準確吸取一定量的噴司他丁標準儲備液（5.4），用超純水分別將其稀釋成濃度為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的工作溶液，使用前配制。5.5濾膜（有機相）：0.22μm。儀器和設備6.1液相色譜儀（帶紫外檢測器）。6.2分析天平：感量0.1mg和感量1mg。。6.3恒溫水浴鍋。6.4粉碎機。6.5離心機。6.6加熱型超聲波粉碎機。7測定方法7.1試樣處理7.1.1蛹蟲草子實體：取蛹蟲草干品進行粉碎，過100目篩子，取篩下物樣品0.5g（精確至0.01g），加入超純水80mL，70℃熱提取1h，過濾，濾液暫存，離心（8800rpm，10min）去除不溶物，用超純水定容至100mL,過濾膜（5.5），取濾液供色譜測定。過濾膜的濾液要在24h內完成測定。7.1.2蛹蟲草菌絲體；取蛹蟲草干品進行粉碎，取粉碎后樣品（過100目篩子）0.5g（精確至0.01g），加入超純水80mL，70℃熱提取1h，過濾，濾液暫存，離心（8800rpm，10min）去除不溶物，用超純水定容至100mL,過濾膜（5.5），取濾液供色譜測定。過濾膜的濾液要在24h內完成測定。7.2高效液相色譜參考條件7.2.1色譜柱：C18柱，柱長250mm、內徑4.6mm、粒徑5μm，或分離效果相當的其他色譜柱。7.2.2流動相：2.5g/L乙酸銨：甲醇：乙腈（96:2:2）。7.2.3流速：1mL/min。7.2.4柱溫：28℃。7.2.5進樣體積：20μL。7.2.6檢測波長：247nm。7.3測定在相同高效液相色譜條件下，依據保留時間對待測樣品進行定性。噴司他丁標準品的色譜圖見圖2。在相同高效液相色譜條件下，依據外標法進行定量。將標準工作液（5.5）按照濃度由低到高的順序進行測定，以峰面積對其相應濃度繪制標準曲線。待測樣品的噴司他丁響應值需在標準曲線的線性范圍內。圖2噴司他丁標準品濃度為0.08mg/ml的HPLC色譜圖7.4結果計算按照式（1）計算待測樣品中噴司他丁的含量：………………（1）式中：X——樣品中噴司他丁的含量，單位為微克每克（mg/kg）；C——根據標準曲線得出的噴司他丁的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V——樣品最終定容體積，單位為毫升（mL）；M——樣品質量數值，單位為克（g）。將符合重復性要求的三個獨立測定值的算術平均值作為測定結果，保留小數點后兩位數值標準曲線與線性范圍HEA標準品的線性回歸方程中R2＞0.999。精密度在重復性條件下獲得標準品的六次峰面積測定結果的相對標準偏差RSD＜2%，精密度良好。10重復性在重復性條件下獲得樣品的六次峰面積測定結果的相對標準偏差RSD＜2%，該方法重復性良好。11穩定性在重復性條件下獲得樣