方法技術驗證是實驗室在使用新標準進行檢驗前或在用標準實質性變更時，用以證實能夠正確運用這些方法的技術性驗證過程，是實驗室質量管理體系中至關重要的一環[1-3]。檢驗檢測機構通過方法驗證，可以對方法的適用性進行評價，以確保檢驗數據準確可靠。運用不經驗證的新方法進行食品檢驗工作，會對結果造成嚴重影響，輕則發生數據偏差，重則對產品判定結果造成影響[4]。目前，仍有很多檢驗檢測機構對食品微生物檢驗方法的技術驗證缺乏認識，引用新標準時，僅通過對標準的培訓、人員能力評價，對照評價設備、培養基、試劑、環境等是否符合標準要求來評價該標準的適用性，缺乏技術性驗證過程[5-6]。本文以《食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7—2013）方法驗證為例，根據標準適用范圍及副溶血性弧菌污染海產品的特性，結合《食品安全國家標準預包裝食品中致病菌限量》（GB29921—2021）[7]及《食品安全國家標準散裝即食食品中致病菌限量》（GB31607—2021）[8]要求，選擇水產制品和水產調味品兩種基質[9-11]作為分析樣本，闡述微生物檢驗方法技術驗證全過程，從食品微生物檢驗方法驗證技術參數、要素的控制，探討微生物檢驗方法驗證工作程序，結合實例，建立食品微生物檢驗方法技術驗證基本模式，為食品檢驗檢測機構提供借鑒和參考。1材料與方法1.1材料與試劑選取水產制品和水產調味品海魚和耗油作為樣品基質，樣品稱量后加入副溶血性弧菌（編號ATCC17802，第2代工作用菌種）菌懸液，按標準要求加入稀釋液，用拍擊式均質器拍擊2min制備樣品勻液。3%氯化鈉堿性蛋白胨水、TCBS平板、弧菌顯色培養基、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、氧化酶試劑、革蘭氏染色劑和干制生化鑒定試劑盒，均由北京陸橋技術有限責任公司提供。1.2儀器與設備T500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、PREVIColorGram全自動革蘭氏染色儀（法國梅里埃公司）、1mL/10mL移液器（德國普蘭德公司）、BD115培養箱（德國BINDER公司）、HBM-400C樣品均質器（天津恒奧科技發展有限公司）及數顯溫濕度計（德國testo公司）。1.3實驗與方法根據定性檢驗和定量檢測要求的不同，選擇方法驗證需要控制的驗證要素。定性檢驗，對方法的檢出水平LOD50進行驗證；定量檢測，從估計偏差、精密度、不確定度評定3方面進行驗證。實驗定性檢驗、定量檢測流程參考《食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7—2013）[12]。2結果與分析2.1定性檢驗因沒有方法的確認資料，估計LOD50≤3CFU/測試單元。取副溶血性弧菌標準菌種制備0.5麥氏濁度菌液，稀釋至10-7，每個稀釋度菌液各取1mL至兩個培養皿，加入3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃培養48h后計數，得到10-6培養皿上菌落數為19CFU，按高（10×LOD50）、中（5×LOD50）、低（1×LOD50），3個接種水平接種量應為30CFU、15CFU、3CFU，制備8個樣品后，兩個高接種水平樣品中加入1.5mL稀釋度10-6菌液，兩個中接種水平樣品中加入0.75mL稀釋度10-6菌液，兩個低接種水平樣品中加入0.15mL稀釋度10-6菌液，剩余兩個為空白樣品。加入標準菌種后，按GB4789.7—2013標準要求進行定性檢驗。參考《微生物檢測方法確認與驗證指南》（RB/T033—2020）要求，根據不同污染水平陽性結果估計LOD50，結果如表1所示。表1副溶血性弧菌定性檢出水平檢測結果表2.2定量檢測2.2.1估計偏差本次驗證針對水產制品和水產調味品兩種基質中副溶血性弧菌進行定量檢測。每種基質選擇3個不同生產企業的不同產品，因所選產品中未檢出目標菌，故進行人工污染。3個產品稱樣后分別添加10-2、10-3、10-4共3個稀釋度的菌液0.1mL，按照GB4789.7—2013標準要求進行檢驗。同時，每個稀釋度各取0.1mL至兩個培養皿，加入3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃培養48h后計數，得到10-4培養皿上菌落數為205CFU、197CFU，樣品取樣量為25g，即加入樣品后樣品中含有副溶血性弧菌量分別為800CFU·g-1、80CFU·g-1、8CFU·g-1。計算檢測結果與加入量的差值（表2），結果與對照結果之差在0.5lgCFU·g-1以內，估計偏差符合要求。表2副溶血性弧菌定量檢測估計偏差檢測結果表2.2.2精密度水產制品和水產調味品兩種基質各取10個樣品，稱量后各加入10-3稀釋度的菌液0.1mL，每個樣品取兩個檢驗單元，分別由檢驗人員A與B完成檢驗，定義為檢驗單元A、檢驗單元B。按照GB4789.7—2013標準要求進行檢驗，檢驗結果見表3。取對數結果求重復性標準偏差，分別為0.1138%（水產制品A）、0.1138%（水產制品B）、0.1138%（水產調味品A）、0.1138%（水產調味品B）。參考《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T151—2016）[13]給出的好氧嗜溫性菌凍蝦的再現性標準偏差為0.18%，此次試驗兩種基質所有檢驗單元檢測結果的重復性標準偏差均小于0.18%，故精密度符合要求。表3副溶血性弧菌精密度檢測結果表單位：MPN·g-12.2.3不確定度評定參考李珍等[14]和朱夕濤等[15]的方法，分析副溶血性弧菌定量檢測不確定度分量的來源，見表4。根據檢驗結果及不確定度分量來源，計算測量不確定度[15]。檢測結果對數值見表5，各不確定度分量結果見表6。水產制品、水產調味品中副溶血性弧菌的合成不確定度均為0.1107，取包含因子k=2，置信概率95%[16]，得到擴展不確定度均為2×0.1107=0.22lgMPN·g-1。副溶血性弧菌含量對數均值均為1.41，則結果報告為101.41±0.22MPN·g-1。表4標準不確定度分量列表表5水產制品和水產調味品副溶血性弧菌定量檢測對數結果表單位：lgMPN·g-1表6副溶血性弧菌定量檢測不確定度評定表3結論本次方法驗證給出水產制品和水產調味品定性檢驗檢出水平分別為2CFU/測試單位、3CFU/測試單位，不高于預估檢出水平，滿足要求。水產制品3種污染水平定量檢測副溶血性弧菌的估計偏差分別為0.35lgCFU·g-1、0.27lgCFU·g-1、0.24lgCFU·g-1，水產調味品的估計偏差為0.35lgCFU·g-1、0.27lgCFU·g-1、0.24lgCFU·g-1，均小于0.5lgCFU·g-1，符合要求；重復性標準偏差均為0.1138%，小于《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T151—2016）給出的再現性標準偏差0.18%，符合要求；方法的擴展不確定度為0.22lgMPN·g-1（k=2，置信概率95%）。實驗從檢出水平、估計偏差、精密度、不確定度評定等方面構建了副溶血性弧菌檢測方法驗證的基本模式，驗證結果滿意，同時給出了不確定度評定方案，為實驗室制定判定規則提供了參考。食品微生物檢驗實驗室正確地實施方法驗證，可以有效控制方法使用過程中的風險[5]。根據本研究中實例分析，建立微生物方法技術驗證的基本模式，