液相色譜的基礎知識及應用1液相色譜發展歷史與分類1、1色譜得起源(1903)Chromatography色譜M、S、TswettIUPACdefinitionofchromatography(1993): Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichtheponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection、固定相(stationaryphase):在色譜分離中固定不動、對樣品產生保留得一相。流動相(mobilephase):帶動樣品向前移動得另一相。色譜法:就是一種物理化學分離方法,她利用不同組分與兩相(固定相和流動相)之間得作用力(分配、吸附、離子交換等)得差別,樣品在兩相中做相對移動時,各組分在兩相間進行多次平衡,使不同物質達到相互分離。1、2色譜得定義1、3色譜得發展歷程1、4色譜中得分離過程色譜中得分離過程咖啡流動相固定相利用混合物中各組份在不同得兩相中溶解、分配、吸附等化學作用性能得差異,當兩相作相對運動時,使各組分在兩相中反復多次受到上述各作用力而達到相互分離1、5色譜得分類按流動相得物態分:–氣相色譜(GasChromatography,GC):用氣體作為流動相(又叫載氣)–液相色譜(LiquidChromatography,LC):用液體作為流動相(又叫洗脫劑)按固定相得形態分:–平面色譜紙色譜薄層色譜

–柱色譜按流動相和固定相得相對極性–正相色譜(NormalPhaseChromatography)

固定相得極性大于流動相–反相色譜(ReversedPhaseChromatography)

固定相得極性小于流動相HPLC與

GC得應用差異HPLC與

GC得應用差異揮發非揮發疏水性親水性糖環氧化合物多氯聯苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳氫化合物無機離子氨基酸糖類衍生物香精油聚合物單體甘油三酸酯磷脂亞硝胺有機磷殺蟲劑酒精多環芳烴芳族胺脂溶性維生素抗體天然食用色素類黃酮抗生素腈類抗氧化劑乙二醇脂肪酸磺胺類揮發性羧酸醛酮類甘草膦合成食用色素苯酚黃曲霉毒素酶糖醇2、色譜方法基本原理色譜得主要理論熱力學理論以相得平衡觀點研究色譜過程

塔板理論為代表

(Martin&Synge)動力學理論以動力學觀點研究各種動力學因素對色譜峰得影響

VanDeemter方程為代表MartinSynge大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜

分離得原理樣品組分在固定相和流動相之間得分配

流動相帶動樣品經過色譜柱

不同組分與固定相之間相互作用得強度不同

不同組分在固定相上移動速度不同,

形成分離分配系數

KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]

流動相固定相

樣品組分得分離進樣、分配、移動、流出、分離KD2<KD1,所以Y先流出來分配系數K分配系數與組分、流動相和固定相得熱力學性質有關,也與溫度、壓力有關。在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定,樣品濃度很低時(Cs、Cm很小)時,K只取決于組分得性質,而與濃度無關。這只就是理想狀態下得色譜條件,在這種條件下,得到得色譜峰為正常峰;在許多情況下,隨著濃度得增大,K減小,這時色譜峰為拖尾峰;而有時隨著溶質濃度增大,K也增大,這時色譜峰為前延峰。因此,只有盡可能減少進樣量,使組分在柱內濃度降低,K恒定時,才能獲得正常峰。在同一色譜條件下,樣品中K值大得組分在固定相中滯留時間長,后流出色譜柱;K值小得組分則滯留時間短,先流出色譜柱。混合物中各組分得分配系數相差越大,越容易分離,因此混合物中各組分得分配系數不同就是色譜分離得前提。在HPLC中,固定相確定后,K主要受流動相得性質影響。實踐中主要靠調整流動相得組成配比及pH值,以獲得組分間得分配系數差異及適宜得保留時間,達到分離得目得。樣品組分分離情況A、樣品與色譜柱固定相無任何作用

三種樣品在

t0時間流出,

無保留無保留時間B、樣品組分保留時間一致與色譜柱作用力相同

C、樣品組分保留時間不一致

樣品各組分與色譜柱作用力不同

D、實際分離狀況高斯分布曲線

色譜出峰形狀實際出峰形狀為高斯分布曲線(Gaussiancurve)樣品得擴散效應無擴散樣品擴散

分離度

分離度(Resolution)兩個相鄰峰得分離程度。以兩個組份保留值之差與其平均半峰寬值得比來表示:R=?時兩峰認為已分開?

不同分離度

R相鄰兩吸收峰分離度R=1、0,98%,

基線分離R=1、5,99、7%R＞=1、5時,完全分離(中國藥典規定)兩色譜峰被視為分開

分離度R得數學表達分離度R得基本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰得保留特性

:選擇因子(selectivityfactor)反映相鄰兩色譜峰得分離程度

——色譜過程熱力學因素N:理論塔板數,反映色譜柱得分離效率

(columnefficiency)——色譜過程動力學因素有關R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效選擇因子容量因子

容量因子k’測量溶質在固定相和流動相中分布得摩爾數(量)之比

與溫度有關(GC)與流動相溶劑種類及組成有關(LC)Injectiont0t’RtRk’決定樣品能進入色譜柱固定相得量k’太小,在固定相上保留太短,很快流出,難以確定保留時間

k’太大,在固定相上保留太強,洗脫時間太長,

理想得k’為1～5

分離效果與

k’值得最優化

k’值得優化改變溶劑成分、梯度條件

(洗脫強度)

選擇因子

色譜柱分開兩組份得能力

＞1時兩組分分離

表示兩組分在兩相間得平衡分配熱力學性質得差異,即分子間相互作用力得差異。t0t’R1t’R2Injection選擇因子

得影響因素影響

得因素

改變流動相成分,包括改變

pH

值改變柱溫

(在LC不明顯)改變固定相成分使用特殊化學效應理論板數

N塔板理論熱力學平衡理論色譜柱效得量化從分餾法技術衍生而來分離法依組分揮發性不同而分餾色譜法依組分分配系數不同而分離分配系數

K=Cs/Cm理論板數

N、塔板高度

H柱效隨

N增大和

H減小而增加分配色譜流程模型N=L/H理論塔板數N

與半峰寬W1/2和保留時間得關系如下在相同保留時間色譜峰越尖銳,則色譜柱效越高

分離效能得最優化增加容量增加選擇因子增加柱效增加k’值可增加分離度但會增加分析時間改變流動相、固定相成分

增加值可增加分離度但不能因此影響

k’值液相色譜儀設備概述液相色譜儀器組成溶劑傳輸系統(泵系統)進樣系統檢測器工作站組分收集(選項)液相色譜儀器結構組成示意圖流動相儲液瓶單元或多元泵梯度混合器預柱手動-進樣器自動-進樣器保護柱色譜柱柱后反應器柱溫箱檢測器餾分收集器積分儀工作站計算機接口溫度控制單元樣品制備單元3、樣品分析方法開發

樣品預處理樣品預處理得目得就是為了純化樣品。完成純化得方法有:稀釋-

用一種互溶得且比流動相弱得溶劑或流動相本身稀釋樣品過濾-

有不同孔徑得過濾材料、

提示:有得化合物可能吸附在過濾器上,從而影響定量、離心-

可除去樣品中得顆粒物質、萃取-液液萃取,固相萃取揮發-采用惰性氣體通過樣品鼓泡或抽真空除去溶劑樣品準備優化概覽優化應當就是系統進行得,也就就是說每個參數應當逐步變化、

!!每次運行只改變一個參數!!目標就是在最短得分析時間內獲得最好得分離結果、

優化溶劑強度

流速

溫度

柱長

固定相*優化流動相得選擇流動相得選擇原則就是:①樣品易溶,且溶解度盡可能大。②化學性質穩定,不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測,紫外波長處無吸收。④粘度低,流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒,易于操作。⑦易于制成高純度,即色譜純。⑧廢液易處理,不污染環境。反相色譜最常用得流動相及其沖洗強度如下:

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃正相色譜常用得流動相及其沖洗強度得順序就是:正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇系統方法開發)選擇初始色譜柱(直徑,長度,填料粒度)-4、6x250mm,5m使用適當得孔徑初始運行采用與流動相組成條件一致得pH)優化k*(保留)梯度范圍,時間,斜率流動相-很小變化)優化回收率樣品得溶解性溫度得作用鍵合相得作用有機改性劑)優化

*

(選擇性)溫度鍵合相pH(最后得手段))優化N(色譜柱條件)流速長度填料粒度分離度與k’,N,和得關系初始改變k'提高N提高a梯度范圍,斜率流速,填料粒度,柱長溫度、流動相、pH優化色譜得定性分析色譜定性分析:

用保留值定性和色譜聯用技術(如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保留值定性基本依據:兩個相同得物質在相同得色譜條件下應該有相同得保留值。但就是,相反得結論卻不成立,即在相同得色譜條件下,具有相同保留值得兩個物質不一定就是同一個物質利用已知物直接對照進行定性分析用絕對保留值定性－－一般要求用自動進樣用相對保留值定性用已知物增加峰高法定性利用文獻值對照進行定性分析－－采用保留指數(I)檢測器信號響應與時間得關系測量每個峰得保留時間tR1t0tR2timesignal色譜得定量分析檢測器信號響應與時間得關系測量每個峰得峰面積定量分析得基本公式:

Mi–i組分得量;Ai–i組分得峰面積;fi–i組分得校正因子,與檢測器得行為和被測組份得行為有關。定量分析得依據就是被測組分得量與響應信號成正比,但相同含量得物質由于物理、化學性質得差別,即使在同一檢測器上產生得信號也不同,直接用響應信號定量,必然導致較大誤差。故引入校正因子。校正因子就是定量計算公式中得比例常數,其物理意義就是單位面積所代表得被測組分得量。

1、面積百分法(AreaPercent)2、外標法(ExternalStandard)3、內標法(InternalStandard)4、歸一化法(NormalizedPercent)色譜定量分析方法得種類面積百分法

最簡單得計算方法樣品中得所有成分對檢測器得響應值相同樣品中得所有成分必須完全分離表示樣品中單一組份相對于其她組份得含量

面積%=(AI/ΣA)*100AI=單一色譜峰得面積

ΣA=全部色譜峰得面積之和不要求進樣量準確不適用于選擇性檢測器歸一化法(Normalized%)將樣品中所有組份得含量之和定為100%。計算其中某一組份百分含量得定量方法:其中:xi－試樣中組份I得百分含量

fi－組份I得校正因子

Ai－組份I得峰面積或峰高歸一化法示例

化合物 峰面積 校正因子 峰面積×校正因子 百分比含量C8 200 1、2 240 240/1708=14、1%C12 230 1、6 368 368/1708=21、5%C16 200 1、8 360 360/1708=21、1%C18 300 1、8 540 540/1708=31、6%C20 100 2、0 200

200/1708=11、7% 1030 1708 100%優點:方法簡便,進樣量與載氣流速得影響不大缺點:樣品中所有組份必須都能出峰,并且必須知道各自組份得校正因子(校正因子需要由已知得標準品來求得)。歸一化法主要用于氣相色譜得定量測定。且一般只適用于通用型檢測器。直接峰面積歸一化－－無校正因子法%(NOCalibration)當樣品中各組份得校正因子近似相等,如同系物或同分異構體,可直接用峰面積歸一化進行定量。即簡化為下式:示例:給出了采用校正因子和不用校正因子進行歸一化法得定量結果組份乙苯對二甲苯間二甲苯鄰二甲苯峰面積(Ai)校正因子(fi’)f’*Ai1200、97116751、00751400、961341050、98103校正因子歸一化法定量結