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文檔簡介

westemblotting步驟及注意事項。一、Westernblotting步驟1.準備樣品a.提取細胞或組織蛋白b.蛋白質濃度測定c.蛋白質變性d.蛋白質樣品處理2.電泳分離a.準備凝膠b.加載樣品c.電泳d.轉膜3.洗膜與抗體結合a.洗膜b.一抗孵育c.洗膜d.二抗孵育4.漫射與顯影a.漫射b.顯影c.定影d.結果分析二、Westernblotting注意事項1.樣品處理a.蛋白質提取方法要合適b.避免蛋白質降解c.嚴格控制蛋白質濃度d.蛋白質變性條件要適宜2.電泳與轉膜a.準確配制凝膠b.控制電泳條件c.選擇合適的轉膜方法d.轉膜效果要良好3.抗體與顯影a.選擇合適的抗體b.控制抗體濃度c.避免抗體交叉反應d.選擇合適的顯影方法三、Westernblotting常見問題及解決方法1.蛋白質提取問題a.蛋白質提取方法不合適b.試劑質量差c.蛋白質降解d.解決方法：優化提取方法，選擇優質試劑，添加蛋白酶抑制劑2.電泳與轉膜問題a.凝膠制備不均勻b.電泳條件不合適c.轉膜效果差d.解決方法：優化凝膠制備，調整電泳條件，選擇合適的轉膜方法3.抗體與顯影問題a.抗體選擇不當b.抗體濃度過高或過低c.抗體交叉反應d.解決方法：選擇合適的抗體，優化抗體濃度，避免抗體交叉反應[1]Harlow,E.,&Lane,D.(1988).Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress.[2]Chien,S.T.,&Chien,S.T.(2002).Westernblotting:Astepstepapproach.HumanaPress.[3]Schagger,H.,&vonJagow,G.(1987).Tricinesodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100kDa.AnalBiochem,166(2),368379.[4]Towbin,H.,Staehelin,T.,&Gordon,J.(1979).Electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:Procedureandsomeapplications.ProcNatlAcadSciUSA,76(9),43504354.[5]Godin

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