鹽脅迫對以漳州水仙生理生化的影響實驗探究摘要本文以漳州水仙為研究對象，通過氯化鈉脅迫、鎂離子脅迫、低磷濃度脅迫處理，測定了水仙葉片POD活性；葉綠素含量；MDA含量，研究漳州水仙的耐鹽性。研究結果表示，氯化鈉脅迫時，水仙葉片葉綠素含量在第3天時平均上升了1.885mmol/L，過氧化物酶活性平均上升了0.66μmol/L，第5天葉綠素平均含量為14.587mmol/L，相比于第3天上升了0.749，而MDA含量在氯化鈉脅迫時一直處于上升的狀態，且在200mmol/L時達到了10.8的最高點；在鎂不足與鎂缺乏時，水仙植株體內葉綠素含量最低為14.598；MDA含量和POD活性都升高了，但是當鎂離子濃度正常時，它們的含量都與對照組水仙體內含量相差無幾；磷濃度極低時葉綠素下降，最低為11.345，缺乏時一定程度上升，濃度正常時與第一天測定時相差不大，水仙體內MDA的含量隨低磷脅迫程度的減小表現了升高的趨勢，重度低磷脅迫(0.001mmol·L-1)時POD活性呈現升高的狀態，最高值達到了7.2。關鍵詞：漳州水仙；氯化鈉脅迫；鎂脅迫；磷脅迫目錄TOC\o"1-3"\h\u22201緒論 7166161.1水仙的介紹 7201831.2鹽脅迫對水仙的傷害 776991.2.1植物對鹽脅迫的抵抗機制 7118921.2.2NaCl對水仙的傷害 819181.2.3鎂離子對水仙的傷害 842331.2.4磷對水仙的傷害 8247971.3研究意義和內容 9301331.3.1研究意義 933641.3.2研究內容 9201312材料與方法 1155552.1材料與設備 11299652.1.1實驗材料 11296432.1.2實驗設備和儀器 11127632.2材料預處理 11222032.3實驗設計 11248612.3.1氯化鈉處理 11216062.3.2鎂離子處理 1227992.3.4低磷處理 1279562.4指標測定 12165352.4.1葉綠素含量測定 12293532.4.2丙二醛（MDA）含量的測定 12182552.4.3過氧化物酶（POD）活性的測定 12155453結果與分析 1398803.1氯化鈉脅迫 13240813.2鎂離子處理 1477023.3低磷處理 1565694討論與結論 1726425參考文獻 199252致謝 21

1緒論1.1水仙的介紹水仙，又名中國水仙。在我國，中國水仙已經有了幾千年的培養種植歷史，屬于石蒜科，又叫天蔥，雅蒜[1]。水仙底下有一個白色的球狀物體，是它的鱗莖，外表面有一層薄薄的棕褐色的膜，球狀物體下面有白色的肉質根，就是水仙吸收水里營養的地方，葉子呢是從莖的上部生長出來，細長，有平行脈，花瓣大多為6瓣，末端為鵝黃色，12月至翌年1月開花，花莖高15－25厘米，有總苞，傘形花序上著生數朵小花[2-3]。水仙顧名思義水中仙子，水中生長，葉子姿態優美，花朵香味淡雅。秋季生長，冬季開花，春季存儲營養，夏季休眠，具有一定的御寒能力，所以多生長于溫暖濕潤的沿海地帶，因此，廈門、福建漳州等沿海地區都是適合水仙種植和生長非常出名的地方。沿海地區生長所以具有一定的抗鹽能力，但具體的能力尚且不清楚。而本實驗會檢測中國水仙在多種類鹽的不同濃度下生理生化的特性。1.2鹽脅迫對水仙的傷害1.2.1植物對鹽脅迫的抵抗機制植物本身具有一定的耐鹽能力，另外植物自身也可以對滲透調節、活性氫的清除，代謝調整離子平衡等問題有調節和解決能力。對于滲透調節，植物合成糖類醇類等大分子有機物，提高細胞滲透壓，增加在高滲透壓環境下的吸水能力。另外除了合成有機物質，植物成長過程中將通過轉運蛋白將環境中的鉀離子吸收到胞內，提高原生質體的滲透勢，調節HKT減少鈉離子的吸收同時升高鈉離子的排出，進入原生質體的鈉離子會通過NHX轉運蛋白進入液泡之中，使液泡-原生質體-質體外滲透勢呈現高低高的濃度，使細胞可以進行正常的代謝活動。對于水仙這種活性氫植物，體內的酶系統在細胞受到傷害時會產生多種酶來保護細胞。普通的植物面對鹽脅迫會減少自身的能量，具有抗氧化能力的植物在清除活性氫時消耗能量更少。對于離子平衡耐鹽植物使大部分鈉離子積累在根系之中，從而減少離子在芽中的含量，保證植物可以正常生長。轉運蛋白可以轉運離子，對離子濃度進行調節，提高鉀離子在植物體內的含量從而增加植物耐鹽性。1.2.2NaCl對水仙的傷害有關鹽脅迫影響植物部分生理生化特性已經有了許多的研究，鹽脅迫會致使植物體多種生理代謝發生變化來順應變化后的環境。有研究表明，氯化鈉脅迫會致使植株葉片中葉綠素含量的減少，會造成高滲透壓使得植株失水，此時植物的葉片的呼吸孔是關上的，光合作用受到阻礙，水仙沒有辦法正常生長發育。一般來說鹽脅迫的原因是鈉離子與氯離子過量，但由于植物的蒸騰作用導致鈉離子與氯離子累計在植物體內，植株身體的滲透壓被破壞，阻止了其他離子進入和釋放，從而阻止植株生長。1.2.3鎂離子對水仙的傷害鎂元素是植物體必須的營養元素之一，當缺鎂時，脂肪、蛋白質、碳水化合物的形成受到阻礙，最終致使植物不能正常生長發育。植物缺少鎂還會出現葉片失去部分綠色等表象，還表現在植物枝干纖弱、鱗莖肉質根數量減少、開花時間變長、顏色不鮮亮、根莖比變小等方面[4]；當鎂營養不足時，會減少植株葉片的葉綠素含量，削弱植株光合作用，蛋白質以及核酸含量變少[5]。根據葉綠素合成與熒光特性的研究表明，無論老葉或是新葉，葉片的光合能力會在嚴重缺鎂時降低;鎂元素作為葉綠素的核心組成成分，參加到了水仙的重要生理生化過程中，當植物缺少鎂時就會出現葉片少綠從而影響了葉片對光能的吸收和轉化、電子傳遞能力以及光合磷酸化[6]。不同類型的水仙對鎂的需求不同，從而對鎂缺乏的耐受性也不同。1.2.4磷對水仙的傷害水仙能夠有效吸收土地里的磷濃度很低，與植物生長需要磷濃度存在很大的差別。因此減少磷脅迫帶來的損失是十分有必要的。與光合作用相關的研究表明,低磷會造成光能轉換和植物效率的利用受到阻礙。研究還表明，降低磷含量會把植物葉片在光能上的能力降低，然后改變光能的轉換和效率。1.3研究意義和內容1.3.1研究意義我國的鹽堿地約占全球的10%，植物在高鹽度條件下無法生存。隨著城市化的不斷推進，農耕面積逐漸減少，而鹽堿地占據我國農耕面積25%，怎樣能讓鹽堿地種植就變得迫在眉睫。沿海區域距離海近的地區土壤平均含鹽量為0.1609%，地下水鹽濃度平均大概為110mmol·L-1，土壤化學元素以鈉離子和氯離子為主。現如今存在的大部分觀賞性植物為非耐鹽生植物，怎樣栽培和繁育耐鹽性比較強的品種花卉來擴大花卉適合種植的區域是主要問題之一。水仙花除了可以賞玩，它的花和根都可以作為藥材[7]。中醫認為水仙能祛風，清熱祛血，調經，治療女性五郁熱，月經不調，還能去氣，但水仙的鱗和莖都有毒，如果被牲畜不小心誤食的話會死。近年來，環境已對水仙花的生長造成不利影響，因此研究不同類型的脅迫對水仙花的生理和生化作用的影響非常重要。1.3.2研究內容為了探究不同鹽脅迫下水仙生理生化特性的變化，本實驗做了氯化鈉脅迫、鎂脅迫和磷脅迫處理。實驗一共測量了三個測試參數，包括MDA含量；POD活性；葉綠素含量。植物進行光合作用的時候，葉綠素是主要的色素，這在水仙的光吸收中起重要作用，不利條件會影響水仙存儲能量，進一步影響水仙的正常生長。衡量植物衰敗跟抗性生理研究常用的一個指標是MDA含量，植株器官衰老或者是在不利環境下受到傷害時，膜脂質過氧化非常容易產生。過氧化物酶活性的強度與植物的耐受性密切相關，可以測量過氧化物酶活性以確定植物對環境的適應性潛力。鹽脅迫是影響植物生長并損害植物滲透壓平衡的主要環境壓力之一，是造成鹽堿地土壤的關鍵原因之一，若鹽脅迫濃度較低，很大程度上還會促進水仙的生長發育，但濃度較高的話則會扼制其生長。近年來土壤鹽堿化問題越來越嚴重，在耕地面積本身較為短缺的情況下，怎樣讓植株在鹽堿地中生存下來就變成了許多科學家研究的問題。在此次實驗中研究水仙生理生化過程與氯化鈉脅迫、鎂脅迫、鉀脅迫的聯系與互作關系，探索水仙在不同鹽脅迫環境下各種指標的變化，來獲知水仙能抵抗多少鹽濃度以及不同鹽對水仙的作用。2材料與方法2.1材料與設備2.1.1實驗材料生長良好的漳州水仙(于某網站進行購買)2.1.2實驗設備和儀器恒溫箱；電子天平；恒溫水浴鍋；紫外分光光度計；微量移液槍；高速冷凍臺式離心機。2.2材料預處理選取十二株種球大小以及外表相差無幾的中國水仙，顏色相同，無病蟲害，將根系修剪至相差不到0.5CM。實驗在實驗室內進行。將由某寶購買的十二株漳州水仙置于實驗室培養，分為四組，每組三株，觀察一星期后，若植株正常生長則開始實驗。首先給每組實驗植株命名，分別為對照組(A1A2A3）、水仙一號（B1B2B3）、水仙二號（C1C2C3）和水仙三號（D1D2D3）。然后將他們移栽到錐形瓶中水培，以便于觀察。2.3實驗設計2.3.1氯化鈉處理把正常環境中生長發育的水仙作為實驗對照組，剩下實驗組NaCl濃度設置四個處理，從低到高為0（CK）、50、100、200mmol·L-1。在處理期間設定的氯化鈉濃度每三天更換一次氯化鈉溶液，每次處理三株，對照組不做處理。在第一、第三、第五、和第七天的早上十點，采集水仙的葉片測定Chl的數值，MDA值和POD活性。葉綠素在光合作用的光吸收中起著中樞作用。氯化鈉脅迫可以變更植株體內的葉綠素含量，進一步會使植物光合作用發生變化。2.3.2鎂離子處理在水仙種植正常生長7天后，把水仙放在有不同濃度鎂的錐形瓶里。設置三個鎂濃度梯度，分別為：鎂缺乏0mmol·L-1，鎂不足0.25mmol·L-1,鎂正常1mmol·L-1，空白對照組不做鎂離子處理。共做三個處理。鎂離子脅迫處理同樣采取為期七天的處理方式，每隔兩天測定一次其生理生化指標。2.3.4低磷處理將準備好的正常生長發育的中國水仙移栽到有培養液的錐形瓶中。對水仙進行三種磷程度處理，各自是0.001、0.005、0.01mmol·L-1。用KH2PO4配置成不同水平濃度的溶液，低磷脅迫處理總共7d，在第一、三、五、七清早采集水仙上的葉片做生理生化指標檢測。為了確保適當的營養，必須丟棄之前所使用的營養液，然后在每次中加入新的。2.4指標測定測定在三種鹽脅迫下水仙的葉綠素含量，丙二醛（MDA）含量，過氧化物酶（POD）活性。2.4.1葉綠素含量測定采用熱醇快速提取法[8]。2.4.2丙二醛（MDA）含量的測定采取TBA比色法[9]。2.4.3過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創木酚法[10]。3結果與分析3.1氯化鈉脅迫由圖1可知，水仙葉片中所含的葉綠素含量相比于第一天，在第3天時平均上升了1.885mmol/L，POD活性平均變大了0.66μmol/L，第5天葉綠素平均含量是14.587mmol/L，相比于第3天上升了0.749，可以知道50mmol/L的鹽濃度對水仙光合作用有一定的幫助。在第一天檢測時，A1號水仙Chl到達頂峰，伴隨著鹽濃度和時間的增加，B1B2B3號的Chl都是升高，但當第三天加入的NaCl濃度為100mmol/L時，實驗組的三株水仙葉綠素含量均有所下降，這說明100mmol/L氯化鈉溶液會抑制水仙的光合作用，影響了水仙進行光合作用的葉綠素酶的活性，從而導致了這樣的結果。當第七天再繼續增高氯化鈉溶液濃度為200mmol/L時，我們可以看到實驗組的三株水仙葉綠素含量有了急劇的下降，推測是鹽脅迫的濃度太高，殺死了水仙體內部分葉綠素酶的活性，進一步造成了葉綠素含量急劇下降的結果。圖1不同時間氯化鈉處理下水仙葉綠素含量的測定（mmol/L)觀察圖2可知，在不同濃度和時間的慢慢進行中，水仙葉片中MDA的含量有一定的浮動，且浮動的趨勢向上，當第五天測定時，MDA含量就有了明顯的增長，這說明第三天添加的鹽濃度對水仙的細胞膜就有了很強的損傷性，然后繼續在第五天加入脅迫溶液，第七天測定MDA，結果顯示含量又繼續增加了。總的來說鹽濃度升高會一定程度的促進水仙的光合作用，但依舊會損傷植物細胞膜系統。圖2圖3圖2、3不同時間氯化鈉處理下水仙MDA含量和POD活性的測定(μmol/L)據圖3可知，鹽脅迫對水仙的葉片過氧化物酶活性有變好的作用。鹽濃度50mmol/L，POD活性增加，但鹽濃度100mmol/L和200mmol/L，POD活性都有所下降，且下降的幅度非常明顯，說明水仙對100mmol/L和200mmol/L的濃度抵抗能力很弱，這個鹽濃度已經十分傷害植株了。3.2鎂離子處理鎂作為植物葉綠體正常結構不可或缺的營養結構，植物葉綠素在缺鎂情況下不能形成，葉片綠色降低致使植物沒有辦法進行光合作用。水仙植株在鎂的不利條件下，葉子都發生了肉眼可見不同程度的綠色減少，并且濃度越低，顏色變淺的現象越明顯。圖4不同時間鎂離子處理下水仙葉綠素含量的測定（mmol/L)觀察圖4可知，隨著鎂離子濃度不斷增加，但是沒有正常鎂水平時，水仙葉片測定出的葉綠素含量與對照組相比均有所減少，這說明缺鎂時水仙進行光合作用的能力確實會減弱，而鎂正常時檢測水仙葉片中葉綠素含量則與對照組的水仙差不多持平，但相對來說會有一些偏低，可能因為水仙葉片在缺鎂以及鎂不足時會有些損傷，導致光合作用能力有所下降。圖5不同鎂離子濃度對水仙MDA含量的測定(μmol/L)觀察圖5，我們知道了POD活性在0mmol·L-1，0.25mmol·L-1與對照相比都是減少，但減少的程度不太相同，在1mmol·L-1的時候POD活性有所增加，且與對照組相比較的話是持平的，這說明鎂含量1mmol·L-1水仙抗氧化性最強。圖6不同鎂離子濃度下水仙POD活性的測定（μmol/L)由圖6可以得知C1C2C3的三株水仙MDA含量在不同濃度并伴隨著時間情況的處理下，在鎂缺乏和鎂不足時，MDA含量都有所增長，且增幅較大，當鎂濃度正常時，則下降至和對照組水仙植株差不多的含量。3.3低磷處理由圖可知，當濃度含量很低時Chl也隨之降低，隨后隨著磷濃度的增加Chl也逐漸恢復，說明缺乏磷會影響植物細胞的分裂，致使植株體內的葉綠素等光和色素減少，蛋白質的化合作用也因為這個受到了影響，酶的活性隨它發生了改變。由于光和色素的減少，植物的代謝途徑發生了變化，因此水仙的生長受到威脅，正常生命活動無法進行。圖7圖8圖7、8不同時間磷離子處理下葉綠素含量、MDA含量的測定圖9不同時間磷離子處理下水仙POD含量的測定(μmol/L)4討論與結論氯化鈉脅迫會使植物體發生多種生理代謝變化以適應新的生長環境。有研究證明氯化鈉脅迫會致使植物葉片中葉綠素的含量減少，含量減少的主要是因為植株受到它的脅迫后葉綠素會加快速度分解而導致合成受到障礙。楊淑萍等研究表明，低鹽濃度會加快海島棉Chl的增加，高鹽濃度會讓葉綠素分解速度加快[11]。本實驗結果顯示確實如楊淑萍等實驗結果相同，B1B2B3號水仙葉片葉綠素含量在第3天時平均上升了1.885mmol/L，而在第五天葉綠素平均數值為14.587mmol/L，相比較于第三天提高了0.749，這個數據更加進一步說明水仙有對逆境的抵抗能力。而觀察單個數據我們發現葉綠素含量還是下降了，這是因為氯化鈉限制了葉綠素的合成,氯化鈉加快了葉綠素的反應速度，致使葉綠素的降解加速，最后會表現葉綠素含量的下降[12]。膜脂過氧化產生的主要物質之一是丙二醛,可以經過測定MDA含量來間接知道細胞膜系統受傷害的程度以及植株對不利環境的抵抗能力[13]。研究表明伴隨著濃度的增加,MDA含量就會增大,進一步破壞了膜的結構和功能，導致代謝發生混亂，且耐鹽性越好的品種，MDA含量上升開間就更小[14]。本實驗中，B1B2B3號水仙植株伴隨濃度變大水仙葉片中積攢了比原來多的MDA，細胞膜正常功能有了損傷是活性氧自由基造成的，說明其不是很耐鹽脅迫。屬于抗氧化酶類的過氧化物酶活性物質的增加可以在不利條件下去除過多的含氧活性物質，以確保植物的健康生長，這在棉花[15]、小麥[16]和高粱[17]上得到了驗證。本實驗中三株水仙葉片的過氧化物酶活性對氯化鈉脅迫反應都相同，POD活性隨著鹽濃度的增大而減小，林雙冀[18]等研究表明，鹽脅迫下，耐鹽性較好的品種，過氧化物酶活性會表現出下降的趨勢，而耐鹽性較差的品種則相反。曾經有人做出了一系列的研究，我們得知POD的活性用來評判水仙種類耐鹽性比較有效。鎂作為葉綠素結構的中心原子，酶的輔助因子，在光合作用中起了重要作用[19]。鎂的過度和缺少都會干預植物的生長，測定指標的變化能反映植物受到鎂威脅時的反應，所以它經常被當做衡量植物抵抗性的標準[10]。本實驗中水仙在鎂是0毫摩爾每升和0.25毫摩爾每升影響下Chl和MDA含量都顯示下降，表明水仙在鎂不足和鎂缺失脅迫下影響了水仙的光合作用以及植物的抗逆性。在植物保護系統中，SOD和POD一起作用的時候可將過氧化氫變為水，把自由基維持在一個比較小的水平，從而避免細胞膜的損傷[20]，本實驗中鎂含量是0mmol/L和0.25mmol/L，C1C2C3號水仙POD活性與A2號水仙相比都在下降，下降程度也會因為鎂離子濃度的升高而增加，表明在0mmol/L和0.25mmol/L下水仙體內的活性氧代謝失去了平衡。研究表明，磷是影響植株正常生長發育的重要元素，磷缺少會導致細胞的光合速率變小，還會減小細胞的呼吸速率。在此次低磷脅迫實驗中，水仙體內丙二醛的含量隨低磷脅迫程度加深而呈現升高的趨勢，表明了水仙細胞膜脂質遭受了活性氧以及自由基的氧化傷害，隨著磷濃度的變少而加重。說明低磷脅迫下水仙受到磷不利條件影響讓葉片產生了不少的自由基，加速了細胞膜脂質過氧化，導致葉片里面MDA含量的增加。水稻、大豆和甘蔗等植物葉片在低磷脅迫下同樣有類似表現[21-23]。重度低磷脅迫（0.001mmol·L-1）時過氧化物酶活性會隨磷濃度的降低來顯示升高的狀態，說明低磷會刺激水仙植株加強對酶活性的保護，更好的減少自由基數量，致使水仙細胞膜脂質的過氧化程度得到了緩和。低磷處理會明顯的降低葉片的凈光合速率[24]，而且還會致使溫州蜜柑葉片凈光合速率有明顯的減小[25]。磷的不利環境下，重新供磷可復原番茄葉片凈光合速率[26]。本實驗表明在磷脅迫下的水仙葉片光合作用會被降低，導致水仙葉片Chl下降。

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