清單04PCR專題一次摘定PCR

面圓回國1

「歲匚二

5'1

9（TC以上變性，DNA雙鏈解開

第“50。（:左右復(fù)性，引物與DNA結(jié)合

3'[

次《5'[

72（延伸，新DNA合成

循

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環(huán)

15T

環(huán)

進(jìn)行第三次循環(huán)變性、復(fù)性

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L【PCR基因定點(diǎn)突變】重疊延伸PCR

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有個(gè)地方不清楚可沿引物3引物43'端延伸

我直接拿手寫這樣方便大家熟悉這個(gè)過程，以免高考題出信息情境題，所以這個(gè)方法還是要了解一下流程。

2.（實(shí)時(shí)）熒光定量PCR技術(shù)

先從樣本中提取RNA,RNA中可能有新冠病毒的RNA,同時(shí)也存在很多采樣患者的組織和存在于采樣部位的微生

物的RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄酶將樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)體系中，包含一對特異性引物

以及一個(gè)Taqman探針，該探針為一段特異性寡核昔酸序列，兩端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針

完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；若反應(yīng)體系存在靶序列，PCR反應(yīng)時(shí)探針與模板結(jié)合，DNA聚

合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)

熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸

濃度越高，Ct值越小（如圖）。

3.RT-PCR技術(shù)

如果想克隆一段已知mRNA序列的cDNA,可使用反轉(zhuǎn)錄酶PCR（reversetranscriptasePCR,RT-PCR）技術(shù)。

RT-PCR與剛才介紹的PCR技術(shù)的主要區(qū)別在于它是從mRNA而不是雙鏈DNA開始的。先利用反向引物在反轉(zhuǎn)錄酶催

化下將mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA；DNA-RNA雜交鏈變性后，再用正向引物將單鏈DNA轉(zhuǎn)換成雙鏈DNA；接著在DNA聚

合酶催化下，正向引物起始cDNA第二鏈合成，將單鏈DNA轉(zhuǎn)換成雙鏈DNA；最后用常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增足量的cDNA

用于克隆。

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反引物)

（bi|?ft：。正臼見的退火

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歸）DNA*fHW

M)UffiM^IWiihPCR

理］因凰氏］

一、單選題

1.（24-25高三上?天津?階段練習(xí)）某種二倍體植物的Pi和P2植株雜交得Fi,Fi自交得F?。對不同個(gè)體的DNA

進(jìn)行PCR檢測，產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖所示，其中①?⑧為部分F?個(gè)體，上部兩條帶是一對等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，下

部兩條帶是另一對等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，這兩對等位基因位于非同源染色體上。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）

ppFF

r1121___________________1____________

①②③④⑤⑥⑦⑧

電源負(fù)極

電源正極

A.①②個(gè)體均為雜合體，F(xiàn),中③所占比例大于⑤

B.還有一種握個(gè)體的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果有三條帶

C.①自交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果有1/2與④電泳結(jié)果相同

D.③和⑦雜交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與②⑧電泳結(jié)果相同

2.（24-25高三上?湖北?期中）圖1是某單基因遺傳病的遺傳系譜圖，該病在人群中的發(fā)病率為1/8100?科研

人員提取了四名女性的DNA,用PCR擴(kuò)增了與此病相關(guān)的基因片段，并對產(chǎn)物酶切后進(jìn)行電泳（正常基因含有一個(gè)

限制酶切位點(diǎn)，突變基因增加了一個(gè)酶切位點(diǎn)），結(jié)果如圖2。相關(guān)敘述正確的是（）

bpI-1n-3n-5

I

□正常男性

o正常女性

口

■?患者

m?

圖1

A.該病的遺傳方式可能為伴X染色體隱性遺傳

B.II-1與II-2婚配生一個(gè)患病男孩的概率為1/91

C.該突變基因新增的酶切位點(diǎn)可能位于310bp或118bp中

D.擴(kuò)增II-2與此病相關(guān)的基因片段，酶切后電泳將產(chǎn)生3種條帶

3.（23-24高三上?浙江?階段練習(xí)）實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）是指先逆轉(zhuǎn)錄得到DNA,然后進(jìn)行PCR

擴(kuò)增。加入的Taqman熒光探針與模板DNA的某條鏈互補(bǔ)結(jié)合，每復(fù)制一次，就有一個(gè)熒光分子生成，當(dāng)熒光強(qiáng)度

達(dá)到一定程度就可以被儀器檢測到，原理如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

（注：Ct值是指PCR擴(kuò)增過程中，緩沖液中的熒光強(qiáng)度首次超過設(shè)定閾值時(shí)，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)。）

A.圖中的TaqDNA聚合酶具有5'外切酶活性

B.熒光報(bào)告基團(tuán)連接在Taqman探針的5'端

C.該P(yáng)CR過程只需要加入1種足量的引物

D.Ct值越小，說明體系中目標(biāo)RNA越多

4.（22-23高三下?河南焦作?階段練習(xí)）RT-PCR是將RNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）成cDNA（與mRNA互補(bǔ)的DNA單鏈）和聚

合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，具體過程如圖所示，下列敘述正確的是（）

T

5'Bn-

3<—S,Tn

3<_

3S'y

57

A.過程I獲得cDNA的過程與DNA復(fù)制過程中存在的堿基配對方式相同

B.圖中A、B兩種引物的核甘酸序列不同，但參與子鏈合成的酶均相同

C.圖中子鏈的合成均是以四種核糖核甘酸為原料從引物的一端開始的

D.過程II中，若進(jìn)行6輪循環(huán)，則共需要加入引物的數(shù)量為63個(gè)

二、多選題

5.（24-25高三上?湖北?階段練習(xí)）某科研小組利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)培育抗凍番茄新品種。設(shè)計(jì)含有非特異性

堿基配對的引物，將突變位點(diǎn)引入編碼抗凍蛋白的基因中，獲得抗凍能力更強(qiáng)的突變基因。下列敘述正確的是（）

擬突變位點(diǎn)

通多/艮5'3型

3年至------3，5,---------------A------------:

—T--------------5，3'---------------T------------

5'-----3'②弓物斗③

引物1I?

f3'、5"3'

八5，^^④1^3八5'

,__________是快變性后，雜交

--------------5'

（⑤

5'?______A______3'

3人______A______5'

突變后的基因

注:引物突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)。

A.過程②還需要四種脫氧核甘酸和耐高溫的DNA連接酶

B.過程③至少需要進(jìn)行2次循環(huán)才能得到兩條鏈等長的DNA分子

C.過程④獲得的2種雜交DNA中只有一種經(jīng)過程⑤能獲得目的基因

D.常采用顯微注射法將獲得的目的基因?qū)敕鸭?xì)胞培育抗凍新品種

三、非選擇題

6.（2024?廣東深圳?模擬預(yù)測）膠原蛋白在維持器官、組織、細(xì)胞等方面發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。科學(xué)家將合成膠

原蛋白的基因kit導(dǎo)入大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌，過程如下圖所示。請據(jù)圖回答下列問題：

注?BamHIxHindHI、EcoRI

為限制髀

tsr為雌絲醵抗性基因

女制原點(diǎn)

⑴若導(dǎo)入到原核生物大腸桿菌中，但由于原核細(xì)胞中缺少（細(xì)胞器），影響表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步加工，可能會(huì)影

響蛋白質(zhì)的功能。

⑵已知kit基因的部分序列如下圖，采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，選用的引物為（填字母）。為使基因與質(zhì)粒

成功連接，需要在引物的端添加兩種限制酶識別序列。

-5'-CGGGATCCA...................................AGAATTCCG-3'

3'-GCCCTAGGT.....................................TCTTAAGGC-5'

A.5,-GCCCTAGGT-3，B.5'—CGGAATTCT-3'

C.5'-CGGGATCCA-3'D.5'—GCCTTAAGA-3'

(3)酶切kit基因，并與質(zhì)粒中長度為170bp片段進(jìn)行置換，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-kit,用HindHI酶分

別酶切pET-28a(+)和pET-28a(+)-kit,獲得如下表所示片段，

質(zhì)粒類型pET—28a(+)pET—28a(+)—kit

HindHI酶切片段lOOObp、2550bplOOObp、2000bp>700bp

則kit基因長度為，由此判定kit基因上有個(gè)HindHI酶切位點(diǎn)。

（4）菌液PCR是直接以菌體熱解后的DNA為模板、以目的基因兩端序列為引物進(jìn)行擴(kuò)增的方法，PCR產(chǎn)物需要用

法進(jìn)行鑒定，若結(jié)果出現(xiàn)大量雜帶，其原因可能有。(答出兩點(diǎn))

7.(24-25高三上?天津?yàn)I海新?階段練習(xí))四尾柵藻是一種淡水藻類，繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)，可作為制備生物柴油

的重要原料之一。為提高四尾柵藻油脂含量，研究人員將從含油量高的紫蘇中獲得的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因

(DGAT1)與pBI121質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化成功獲得高產(chǎn)油脂四尾柵藻，主要研究過程如下圖，其中DGAT1-F

(5-GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC—3')和DGATl-RC5f-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTITTC-3,)

是以DGAT1基因?yàn)橐罁?jù)設(shè)計(jì)的一對引物，lacZ基因編碼產(chǎn)物在X-gal和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落

呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色。請回答下列問題。

①DGAT1

紫蘇總RNA衛(wèi)波

卡那霉素啟動(dòng)子

RT-PCR抗性基因,

DGAT1-FPBI121

DGAT1-R載體終止子

復(fù)制原點(diǎn)(4349bp)力轉(zhuǎn)換DGAT1(14756bp)

端選大腸桿菌I復(fù)制原點(diǎn)

氨葦青霉素

抗性基因④

限制酶識別序列及切割位點(diǎn)

轉(zhuǎn)化表達(dá)

BamHI5,GfGATCC3'四尾柵藻二一載體

SacI5'GAGCTfC3'

Xba\5，TlCTAGA3'

EcoRI5'GfAATTC3'

(1)過程①中需要的酶有.和，過程②應(yīng)選用的限制酶是._____和一

(2)在保存DGAT1基因時(shí)，將克隆載體導(dǎo)入大腸桿菌的優(yōu)點(diǎn)有.(多選)。

①穩(wěn)定保存②準(zhǔn)確復(fù)制③快速表達(dá)④方便取用

(3)過程③經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌通過(方法)接種到培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。為篩選獲得目標(biāo)菌株，培養(yǎng)基應(yīng)加入

的成分有=

(4)為檢測表達(dá)載體轉(zhuǎn)化四尾柵藻的情況及確定目的基因是否表達(dá)，研究人員進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)，請完成下表。

實(shí)驗(yàn)步驟簡要操作過程

經(jīng)轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻接種于含①_____的BGH固體培養(yǎng)基并放置于人工氣候箱培養(yǎng)，一段時(shí)間后觀

初篩培養(yǎng)

察其生長情況

擴(kuò)大培養(yǎng)在BG11固體培養(yǎng)基上分別挑取數(shù)個(gè)單藻落接種至BG11液體培養(yǎng)基中光照搖床培養(yǎng)，編號備用

收集四尾柵藻藻體，提取基因組DNA,以DGAT1-F和DGAT1-R為引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，未轉(zhuǎn)化的四尾

PCR驗(yàn)證

柵藻作對照

油脂含量測

利用索氏抽提法，分別測定②_____的油脂含量

定

結(jié)果處理統(tǒng)計(jì)并比較PCR驗(yàn)證結(jié)果及藻體中油脂的含量

8.(24-25高三上?江西贛州?階段練習(xí))番茄不耐寒，冬季容易凍壞，難以儲藏。我國科研人員從某植物中提取

了一種抗凍基因AtC0R15a,經(jīng)過一系列過程獲得轉(zhuǎn)基因抗凍的番茄新品種，操作流程如圖。回答下列問題：

轉(zhuǎn)基因的

番茄幼苗

（1）用PCR技術(shù)擴(kuò)增AtCORl5a基因時(shí)需要添加引物，引物的作用是。

（2）如果要將AtCORl5a基因與質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子，一般采用雙酶切法，據(jù)圖分析選用的兩種限制酶組合

是O

（3）圖中是采用法將目的基因轉(zhuǎn)移到番茄細(xì)胞中，并將其整合到該細(xì)胞的上。

⑷為了提高AtCOR15a基因的表達(dá)能力，可將AtCOR15a基因與外源強(qiáng)啟動(dòng)子連接，如下圖所示。

—

強(qiáng)啟動(dòng)子一AtCOR15as因（注：圖中①、②、③、④表示引物）

④③

利用PCR檢測上述連接是否正確，可選擇的引物組合是（填字母），該P(yáng)CR反應(yīng)體系中需加入—

酶。

A.①+②B.①+③C.②+③D.③+④

9.（22-23高二下?江蘇揚(yáng)州?階段練習(xí)）引起新冠肺炎的新冠病毒是一種帶包膜的RNA病毒，包膜表面有與人體

細(xì)胞膜表面的ACE2受體結(jié)合的S蛋白。疫苗接種和病毒檢測是當(dāng)前新冠肺炎疫情防控工作的重要舉措。請回答下

列問題：

I、疫苗的研發(fā)和接種

（1）滅活疫苗。工業(yè)生產(chǎn)上利用Vero細(xì)胞能無限增殖的特性培養(yǎng)新冠病毒，可實(shí)現(xiàn)的目的。

（2）腺病毒載體疫苗。該疫苗主要成分是活的、有復(fù)制缺陷、能表達(dá)S蛋白的重組人5型腺病毒。這種方式生產(chǎn)的

疫苗由于重組腺病毒，從而提高了疫苗的安全性。

（3）重組亞單位疫苗。其技術(shù)線路是：提取新冠病毒RNA-通過RT酶PCR（反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)擴(kuò)增篩

選RBD蛋白（S蛋白中真正與ACE2結(jié)合的關(guān)鍵部分）基因一構(gòu)建基因表達(dá)載體一導(dǎo)入CHO細(xì)胞并培養(yǎng)一提取并純化

RBD蛋白一制成疫苗。利用RT酶PCR技術(shù)，獲取S蛋白基因時(shí)，需加入酶；擴(kuò)增RBD蛋白基因時(shí)，應(yīng)選擇的

引物為。PCR的產(chǎn)物可通過電泳鑒定，設(shè)置如下：1號泳道為標(biāo)準(zhǔn)（Marker）,2號泳道是以為材料做的

陽性對照組，3號泳道為實(shí)驗(yàn)組。圖3中3號泳道出現(xiàn)雜帶，原因一般有（至少答出兩點(diǎn)）。基因表達(dá)載體構(gòu)

建中為提高目的基因和運(yùn)載體的正確連接效率，研究人員應(yīng)在圖1中選擇的限制酶是o

123

EcoRISmaIEcoRI

標(biāo)記基因BamHIHindDIEcoRI

引物1引物引物4

5'Z±1口川川川鵬川二：

…4引物6引物71引物8圖2運(yùn)載體片段示意圖

X

BamHIRBD蛋-W基因~'HindID

圖1RBD蛋白基因結(jié)構(gòu)與引物位置示意圖

圖3

II、新冠病毒的檢測

（4）核酸檢測

圖4是我國自主設(shè)計(jì)的新冠病毒核酸檢測平臺示意圖，圖5為RT-PCR（實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）示意圖。

當(dāng)探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)（R）發(fā)出的熒光信號被淬滅基團(tuán)（Q）吸收而不發(fā)熒光；當(dāng)Taq酶遇到探針時(shí)會(huì)使探針?biāo)?/p>

解而釋放出游離的R和Q,R發(fā)出的熒光信號被相應(yīng)儀器檢測到，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步。

病毒樣品RNA------------------------------------------------

I

[a的困§脂曾

坪木?病毒.樣本信?自動(dòng)化+自動(dòng)%+自動(dòng)WR.RT雙鏈DNA=

樣本+滅活十息錄入.分裝?核酸提取+體系配置.暗刊引物、探針與模板鏈疆扇“aqMan探針

—|施

全自動(dòng)分杯全自動(dòng)核酸自動(dòng)化液體

處理系統(tǒng)提取純化儀處理系統(tǒng)新鏈延伸遇到探包一圾八嘎、

I1I

Taq酶切割嬴

廠樣」熒光：眼、?，嘀洞、

實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)

新儀鏈器聚檢-測完成毛牛恤?）?僉一.J二

圖4

初徒不口兀取______________I_________________________________

圖5

①在自動(dòng)化PCR體系配置中加入引物和探針，引物和探針與模板結(jié)合發(fā)生在PCR循環(huán)中的階段。

②利用熒光定量PCR儀可監(jiān)測待測樣液中病毒的核酸數(shù)量。若每斷裂一個(gè)TaqMan探針，設(shè)置R發(fā)出的熒光信號的

值為L若經(jīng)n次的PCR擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光信號強(qiáng)度（填“增強(qiáng)”“減弱”或“不變”），說明樣液中病毒的核

酸數(shù)量為0；

（5）抗原和抗體檢測：為了及早發(fā)現(xiàn)新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原檢測試劑盒及抗體檢測試劑盒作為核酸檢測

的有效補(bǔ)充措施。對于已注射過滅活疫苗的人員，應(yīng)選擇（填字母）檢測。

a、核酸檢測b、抗原檢測c、抗體檢測

10.（22-23高三上?江蘇揚(yáng)州?階段練習(xí)）科研人員發(fā)現(xiàn)在人類腫瘤細(xì)胞中LMNA基因表達(dá)異常，LMNA基因編碼

的核纖層蛋白與維持細(xì)胞核的正常形態(tài)有關(guān)。科研人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對體外培養(yǎng)的HepG2（人源肺癌細(xì)胞）

細(xì)胞株進(jìn)行基因編輯，獲得了LMNA基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。

（l）Cas9是一種核酸內(nèi)切酶，它與sgRNA（向?qū)NA）構(gòu)成的復(fù)合體能與DNA分子特定堿基序列結(jié)合，如圖1。作用

時(shí)sgRNA與DNA單鏈進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，然后Cas9催化水解，從而使DNA在PAM序列（幾乎存在于所有

基因中）的（填“上游”或“下游”）被切斷。

，Cas9

73'_

J-5'-fsgRNA

NGGPAM序列

（N表示任意堿基）

UHL基因組DNA

&Cas9切點(diǎn)

圖1

⑵一般來說，在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對不同基因進(jìn)行編輯時(shí)，應(yīng)使用Cas9和（填“相同”或“不同”）

的sgRNA結(jié)合構(gòu)成復(fù)合體進(jìn)行相關(guān)基因的編輯，其中Cas9對DNA的切割（填“具有”或“不具有”）

類似于限制酶的“限制性”。

（3）HepG2細(xì)胞中沒有編碼Cas9的基因，需將Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并與質(zhì)粒結(jié)合導(dǎo)入HepG2

細(xì)胞，sgRNA的合成需要酶的催化。

⑷用圖2中的質(zhì)粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選用進(jìn)行酶切。將構(gòu)建好的表

達(dá)載體與用處理的細(xì)菌置于適宜反應(yīng)體系中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)菌涂布于含的平板培養(yǎng)

基上，37℃培養(yǎng)，24h后挑取菌落，提取質(zhì)粒作為模板，選擇圖3中引物組合和，通過PCR和電

泳技術(shù)鑒定是否重組成功。

拼接基因插入位置

5，一“CCGTGT…"■■”?ATGCCT…-3，5-...GGGATG'—3'

3'—.GGCACA-H--TACGGA--5'3'—"CCCTAG--5'

I_______________?______________III

插入部位兩端拼接.因

|-I5'-…GATCCC”?-3'

EcoRIEcoRIBamHI

3種引物-II5'-…AGGCAT…-3'

-III5--CCGTGT…-3'

Cas9-sgRNA拼接基因

圖3

圖2

(5)用鑒定成功的工程菌對HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)三天后收集HepG2細(xì)胞，從分子水平和細(xì)胞水平檢測導(dǎo)入是

否成功。

①提取HepG2細(xì)胞的基因組，對DNA分子的序列進(jìn)行檢測。

②請寫出細(xì)胞水平的一項(xiàng)檢測指標(biāo)：o

11.(2024高三上?廣東江門?專題練習(xí))在未斷奶的小牛胃中存在一種凝乳酶，其凝乳功能可使奶制品形成獨(dú)特

風(fēng)味和質(zhì)地，因此被廣泛應(yīng)用于奶酪和酸奶生產(chǎn)。現(xiàn)利用生物工程大量生產(chǎn)牛凝乳酶，如圖為目的基因及質(zhì)粒的示

意圖，請回答相關(guān)問題。

PlP2

a鏈R，--一

b鏈;二

—.—

P3牛凝乳酶cDNA04注：

P1?P4:引物

Ampt氨羊青霉素抗性基因

LacZ:B-半乳糖甘酶基因，編

碼的酶能將無色化合物X-盟1切

割成半乳糖和藍(lán)色物質(zhì)，使菌落

呈現(xiàn)藍(lán)色；否則菌落為白色

(1)圖中的牛凝乳酶cDNA是由未斷奶小牛胃細(xì)胞中分離出的mRNA經(jīng)過程獲得。

(2)已知牛凝乳酶cDNA中的b鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，為實(shí)現(xiàn)牛凝乳酶基因與質(zhì)粒的準(zhǔn)確連接，PCR擴(kuò)增牛凝乳酶cDNA

時(shí)需選擇適當(dāng)?shù)囊锊⒃谝锏?'端添加相應(yīng)的限制酶識別序列。請據(jù)圖分析并完成下表：

應(yīng)選擇的引物5'端添加序列所對應(yīng)的限制酶

?______NeoI

P2②_______

(3)將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌后，用含的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體菌，進(jìn)行鑒定。含重組質(zhì)粒的菌落將呈現(xiàn)白色，

原因是=

(4)與細(xì)菌相比，選用具有酵母菌作為受體菌更能對目的基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行(填“轉(zhuǎn)錄”或“翻譯”)后

修飾，使凝乳酶具有更優(yōu)的生物學(xué)活性。由于不同物種對編碼相同氨基酸的不同密碼子的使用頻率存在差異，當(dāng)外

源基因的密碼子對應(yīng)的在受體細(xì)胞中數(shù)量較少時(shí)就會(huì)影響翻譯的效率。

12.（24-25圖三上?浙江杭州?階段練習(xí)）研究人員從分解纖維素的細(xì)菌（A菌）中提取出一種纖維素酶基因（CBHH）

并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后與高效表達(dá)載體DUT質(zhì)粒（圖1）連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒并導(dǎo)入A菌，從而獲得分解纖維素能

力更強(qiáng)的工程菌（B菌），請回答下列問題：

Bgin

高效表達(dá)啟動(dòng)子n

弓鷺

SacI抗生素MCBHnA鏈5'______________^3，

抗性基因

基因15鏈3二一廊L'

MspIPUT質(zhì)粒

引物11連接

抗生素N

pUT質(zhì)粒||啟動(dòng)子

抗性基因

BamHI

圖1圖2

標(biāo)準(zhǔn)DNACBHII123

23130bp

9416bpWU

4557bp6

S1

4361bp和

O

2233bp量8

1356bp

%)4

1120bp

0-

對照組1對照組2B菌

圖3圖4

限制酶識別序列及酶切位點(diǎn)

Bglll5'-A1GATCT-3'

BstEH5*-GIGTNACC-3'（N為任意堿基）

SacI5'-G\AGCTC-3'

MspI5'-C3CGG-3'

BamHI5'-G\GATCC-3"

幾種限制酶識別序列及酶切位點(diǎn)

（1）構(gòu)建成重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選擇限制酶對PUT質(zhì)粒進(jìn)行酶切，經(jīng)酶切后形成了兩個(gè)DNA片段（X和Y）,X

兩端的黏性末端分別為-CTAG和-CAATG,則Y兩端的黏性末端分別為-CTAG和。

（2）CBHII基因中無上述限制酶的酶切位點(diǎn)，兩端需添加相關(guān)酶切位點(diǎn)才能在酶切后與pUT質(zhì)粒連接，PCR擴(kuò)增過程

中，最早經(jīng)過輪循環(huán)后，便可獲得兩端均攜帶限制酶識別序列的所需雙鏈目的基因。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊

脂糖凝膠電泳來鑒定。為了能在波長為300nm紫外燈下檢測出DNA分子，需要在瓊脂糖溶液中加入適量的。

（3）為鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功以及是否成功導(dǎo)入A菌，將其接種在含抗生素（填“M”或"N”）的培養(yǎng)

基上培養(yǎng)，將3個(gè)不同菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3所示（片段過小時(shí)檢測不

到條帶）。據(jù)圖分析，菌落中成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒。

（4）為檢測B菌的纖維素分解能力，將含有20%纖維素的培養(yǎng)基分為三組，進(jìn)行不同處理后，在相同條件下培養(yǎng)一段

時(shí)間，測定培養(yǎng)基中纖維素含量，結(jié)果如圖4所示，對照組2的處理為接種,說明o

13.（2024?四川巴中?一模）巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（NestedPCR）屬于普通PCR的衍生技術(shù)，相較于普通PCR,

巢式PCR能有效提高產(chǎn)物中目的基因的比例，增加PCR的靈敏度和特異性。巢式PCR通常包括兩個(gè)連續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)，

每個(gè)反應(yīng)使用不同的一對引物。第一次PCR用一對外引物進(jìn)行擴(kuò)增，其產(chǎn)物會(huì)被用作第二次PCR的模板，第二次PCR

由一對內(nèi)引物（結(jié)合位點(diǎn)位于外引物對結(jié)合點(diǎn)的內(nèi)部）擴(kuò)增目的基因，過程如下圖所示。

目的菁因序列

31

模板DNA

51

3,

5,

第一次

PCR

第二次

PCR

（1）巢式PCR反應(yīng)體系所需的試劑如下，請補(bǔ)齊空白處：

PCR反應(yīng)緩沖液（含有MgCk）

dNTP混合液（所有四種dNTP,即dATP、dTTP、dCTP、dGTP）

引物：內(nèi)引物1,內(nèi)引物2,外引物1,外引物2

模板DNA

H20

其中PCR反應(yīng)緩沖液中Mg"的作用是，相比直接使用4種脫氧核甘酸，在反應(yīng)體系中加入dNTP的優(yōu)勢有

（2）與普通PCR相比巢式PCR中設(shè)計(jì)的引物只是在模板DNA的結(jié)合位置有所差異。進(jìn)行巢式PCR前，根據(jù)已知的模

板DNA序列，可設(shè)計(jì)合成內(nèi)外引物對，引物設(shè)計(jì)的要求有（答出兩點(diǎn)即可）；同時(shí)，為方便擴(kuò)增產(chǎn)物后續(xù)的

操作，可在引物的（填“5,端”或“3,端”）添加限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。

（3）將題（1）中試劑按順序加入擴(kuò)增離心管中，按下表參數(shù)在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增：

周期數(shù)變性復(fù)性延伸

1-3094℃下30s50℃下30s72℃下2.5min

在擴(kuò)增后對PCR的產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)較多的非特異性條帶，此時(shí)可適當(dāng)（填“提高”或“降低”）

復(fù)性溫度來減少非特異性條帶，原因是o

（4）巢式PCR可大大提高擴(kuò)增特異性的原因是o

14.（2024?湖南長沙?二模）對某冠狀病毒進(jìn)行核酸檢測其實(shí)就是對病毒的遺傳物質(zhì)RNA進(jìn)行檢測。目前主流方

法為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法。為檢測某人是否感染了該冠狀病毒，需要進(jìn)行以下相關(guān)操作：

①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從組織樣本中提取RNA；③RT（逆轉(zhuǎn)錄）成cDNA；④采集樣本（咽拭子或鼻拭子）；⑤利

用PCR擴(kuò)增DNA片段。回答下列問題：

(1)若要得到正確的核酸檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是(用數(shù)字序號表示)。核酸檢

測樣本多采集于咽、鼻，這些部位存在多種微生物，提取物中核酸種類可能有多種，但通過PCR技術(shù)可專一地對該

冠狀病毒的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，原因是o

(2)操作⑤中，需設(shè)計(jì)2種引物，需要提供引物的原因是；復(fù)性時(shí)溫度的設(shè)定是該步操作

成敗的關(guān)鍵，而復(fù)性的作用是。

(3)PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入引物的同時(shí)還需加入一個(gè)特異性熒光探針，其兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán),

如圖所示：

,正向引物_/探針&2

,5

,YMrrW\滔;蕓會(huì)3

5

3

合反向引物

1^=報(bào)告基團(tuán)(?=淬滅基團(tuán)

5

3

5

2.鏈取代

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；在催化子鏈延伸時(shí)，還具有外切

酶活性，它可以沿著(填“5'-3'”或"3'-5'")方向?qū)⑻结樏盖校箞?bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，

隨著DNA擴(kuò)增次數(shù)的增加，熒光的強(qiáng)度會(huì)逐漸增大，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號的變化與的形成完全

同步。

(4)除了熒光檢測法，還可以通過法分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。

15.(23-24高三上?廣東?階段練習(xí))研究表明，Lm-PHB2蛋白在細(xì)胞核內(nèi)起調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。為研究Lm-PHB2

蛋白的生物學(xué)活性，研究人員進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄，RT)和cDNA的聚合酶鏈擴(kuò)

增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)，LacZ基因的編碼產(chǎn)物在x-gal和IPTG存在下，可使大腸桿菌菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌

落呈現(xiàn)白色。回答下列問題.

Lm-PHB2①：_

基因mRNART-PCRLm-PHB2

基因

(1)過程①需要的酶有該過程需要在目的基因上添加適宜的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增時(shí)，引物和酶切位點(diǎn)的設(shè)

計(jì)依據(jù)分別是Lm-PHB2基因兩側(cè)的脫氧核甘酸序列和0

(2)過程③中篩選和培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中需要加入和碳源、氮源、水和無機(jī)鹽等物質(zhì)，挑取色

菌落中的微生物培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用限制酶進(jìn)行酶切，再對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

(3)為檢測過程⑤得到的大腸桿菌是否表達(dá)Lm-PHB2基因，研究人員以注射了后獲得的小鼠B淋巴細(xì)胞和骨

髓瘤細(xì)胞制備單克隆抗體，之后再用制備的單克隆抗體與大腸桿菌中蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

16.(22-23高二下?湖南?階段練習(xí))聚乳酸(PLA)具有良好的生物可降解性與相容性，其機(jī)械性能及物理性能

良好，被認(rèn)為是傳統(tǒng)石化來源類塑料的環(huán)保替代品。PLA可以以三種立體結(jié)構(gòu)存在：聚L一乳酸(PLLA)、聚D一乳

酸(PDLA)和聚DL一乳酸(PDLLA),它們分別是L一乳酸、D一乳酸和DL-乳酸的聚合物。幾乎所有的乳酸菌都同

時(shí)具有L一乳酸脫氫酶(L—LDH)和D一乳酸脫氫酶(D—LDH)。

(1)已知乳酸芽抱桿菌可生產(chǎn)純度相對較高的D一乳酸，其在無氧情況下，能將葡萄糖分解為乳酸，反應(yīng)簡式

為。

(2)為得到足夠濃度的乳酸芽抱桿菌，研究者對其進(jìn)行富集培養(yǎng)，并且每間隔一段時(shí)間采用法進(jìn)

行活菌計(jì)數(shù)。某次實(shí)驗(yàn)時(shí)，甲、乙兩組研究者分別吸取經(jīng)稀釋10倍的菌液0.1mL進(jìn)行涂布后計(jì)數(shù)，甲組統(tǒng)計(jì)的菌

落數(shù)分別為45、40、37,乙組統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為280、350、295,請計(jì)算出此時(shí)培養(yǎng)液中乳酸芽抱桿菌濃度為一

(保留小數(shù)點(diǎn)后一位)個(gè)/mL。

(3)為增加D—乳酸的產(chǎn)量,科學(xué)家對乳酸芽抱桿菌的D-LDH基因特定位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，以增強(qiáng)D-LDH的活性。

重疊延伸PCR技術(shù)是常見的定點(diǎn)突變手段之一，其過程如下圖所示：

/「擬突變位點(diǎn)

5?4:v—Li

3-__________M____________yD-L