1T/GDFCA104—2025光果甘草根提取物中主要有效成分含量的測定高效液相色譜法警示——使用本文件的人員應有正規(guī)實驗室工作的實踐經(jīng)驗。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當?shù)陌踩徒】荡胧⒈ＷC符合國家有關法規(guī)規(guī)定的條件。本文件描述了高效液相色譜法測定光果甘草根提取物中主要有效成分含量的方法，包括方法的原理、試劑和材料、儀器和設備、試樣的制備、分析步驟、結果計算、精密度等要求。本文件適用于光果甘草根提取物中黃酮類標志物（光甘草定和芒柄花黃素）和三萜類標志物（光甘草醇和甘草內(nèi)酯）含量的測定，其他固體、半固體植物提取物可參照執(zhí)行。本文件不適用于光甘草定≥50%的光果甘草根提取物。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理試樣經(jīng)甲醇超聲提取，過濾，續(xù)濾液中各物質經(jīng)液相色譜柱分離后，用紫外檢測器進行檢測，用保留時間進行定性，外標法定量。5試劑和材料5.1甲醇（CH3OH，CAS號：67-56-1）：色譜純。5.2乙腈（C2H3N，CAS號：75-05-8）：色譜純。5.3磷酸（H3PO4，CAS號：7664-38-2）：分析純。5.40.05%磷酸水溶液：取500μL磷酸（見5.3），加一級水定容至1L。5.5標準物質具體包括：——光甘草定標準物質（Glabridin，C20H20O4，CAS號：59870-68-7），純度≥98%；——芒柄花黃素標準物質（Formononetin，C16H12O4，CAS號：485-72-3），純度≥98%；——光甘草醇標準物質（Glabrol，C25H28O4，CAS號：59870-65-4），純度≥98%；——甘草內(nèi)酯標準物質（Glabrolide，C30H44O4，CAS號：10401-33-9），純度≥98%。5.6標準儲備液的類別及制備步驟具體包括：——甘草內(nèi)酯標準儲備液（2000mg/L）：準確稱取20mg（精確至0.1mg）甘草內(nèi)酯標準物質（見5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標準儲備液避光于0℃~4℃下儲存，有效期2個月；2T/GDFCA104—2025——芒柄花黃素標準儲備液（1000mg/L）：準確稱取10mg（精確至0.1mg）芒柄花黃素標準物質（5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標準儲備液避光于0℃~4℃下儲存，有效期2個月；——光甘草定標準儲備液（1000mg/L）：準確稱取10mg（精確至0.1mg）光甘草定標準物質（見5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標準儲備液避光于0℃~4℃下儲存，有效期2個月；——光甘草醇標準儲備液（1000mg/L）：準確稱取10mg（精確至0.1mg）光甘草醇標準物質（見5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標準儲備液避光于0℃-4℃下儲存，有效期2個月。5.7標準工作溶液的類別及制備步驟包括：——芒柄花黃素標準工作溶液：分別吸取適量的芒柄花黃素標準儲備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的標準工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當調節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配。——光甘草定標準工作液：分別吸取適量的光甘草定標準儲備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L的標準工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當調節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配；——光甘草醇標準工作液：分別吸取適量的光甘草醇標準儲備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L的標準工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當調節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配；——甘草內(nèi)酯標準工作溶液：分別吸取適量的甘草內(nèi)酯標準儲備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L的標準工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當調節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配。5.8實驗材料：離心管、燒杯、量筒、移液槍、注射器、微孔濾膜（孔徑0.22μm，有機系）。注：除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。6儀器和設備6.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測器（或二極管陣列檢測器）。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3超聲波清洗器：功率不低于480W、頻率支持40kHz。6.4高速離心機：轉速不低于8000r/min。7測定步驟7.1樣品預處理精密稱取0.5g（精確至0.0001g）甘草提取物粉末于50mL離心管中，加入25mL甲醇充分溶解，稱量。在超聲水浴溫度25℃條件下超聲提取30min，冷卻至室溫后稱量，用甲醇補足余量，避光儲存，以4000r/min離心5min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液用稀釋一定倍數(shù)為供試品溶液(建議檢測甘草內(nèi)酯不稀釋，檢測光甘草醇、芒柄花黃素稀釋10倍、檢測光甘草定稀釋20倍)。7.2液相色譜參考條件7.2.1色譜柱：C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），或性能相當者。7.2.2柱溫：35℃。7.2.3流動相：乙腈、0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫。梯度洗脫條件見表1和表2。表1光甘草定、芒柄花黃素檢測的洗脫條件053T/GDFCA104—20255表1光甘草定、芒柄花黃素檢測的洗脫條件（續(xù)）表2甘草內(nèi)酯、光甘草醇檢測的洗脫條件min0557.2.4檢測波長：280nm。7.2.5進樣量：20μL。7.2.6流速：1.0mL/min。7.3液相色譜測定按照7.2色譜條件分別對標準工作溶液和樣品試液進行檢測，得到相應的標準工作液和樣品試液中光甘草定、芒柄花黃素、光甘草醇、甘草內(nèi)酯的色譜峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。以保留時間對樣品進行定性，保留時間允許誤差范圍為1%，標準曲線外標法對樣品定量。當檢測樣品基質復雜，雜質干擾后續(xù)檢測時，可適當調整色譜條件。典型色譜圖參見附錄A。7.4空白試驗除不加試樣外，采用與試樣完全相同的分析步驟進行。8結果計算和表述8.1試樣中物質含量按式(1)計算：式中：?——試樣中標志物含量，單位為毫克每克（mg/g）；?——根據(jù)標準曲線測得樣品溶液各標志物質量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；0——根據(jù)標準曲線測得空白溶液各標志物質量濃度，單位為毫克每升（mg/L?——樣品定容體積，單位為升（Lf——樣品溶液稀釋倍數(shù)；?——稱取樣品粉末的質量，單位為克（g）。8.2計算結果應扣除空白值，計算結果用平行測定的算數(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。9檢出限、定量限本方法對芒柄花黃素、光甘草定、光甘草醇和甘草內(nèi)酯的檢測限和定量限見表3。表3芒柄花黃素、光甘草定、光甘草醇和甘草內(nèi)酯的檢測限和定量限4T/GDFCA104—2025mg/g表3芒柄花黃素、光甘草定、光甘草醇和甘草內(nèi)酯的檢測限和定量限（續(xù)）mg/g2510精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算數(shù)平均值的10%。本方法檢測芒柄花黃素的線性范圍為10mg/L~100mg/L，檢測光甘草定芒、柄花黃素、光甘草醇的線性范圍為100mg/L~1000mg/L，甘草內(nèi)酯的線性范圍為200mg/L~1200mg/L，標準曲線相關系數(shù)≥0.99，標準品添加量在待測樣品濃度0.5~1.5倍濃度范圍內(nèi)，回收率范圍為80%～120%。5T/GDFCA104—2025高效液相色譜法測定光果甘草根提取物主要有效成分的典型色譜圖A.1光甘草定物質色譜圖，見圖A.1。圖A.1光甘草定標準物質色譜圖（1000mg/L）A.2芒柄花黃素物質色譜圖，見圖A.2。圖A.2芒柄花黃素標準物質色譜圖（100mg/L）T/GDFCA104—2025A.3光甘草醇物質色譜圖，見圖A.4。圖A.3光甘草醇標準物質色譜圖（800mg/L）A.4甘草內(nèi)酯物質色譜圖，見圖A.4。圖A.4甘草內(nèi)酯標準物質色譜圖（800mg/L）7T/GDFCA104—2025A.5光甘草定-40光果甘草根提取物樣品色譜圖，見圖5.1