醫學實驗室定量檢驗方法

的分析性能評價主要內容檢測系統的分析性能檢驗質量目標的設定精密度評價實驗正確度評價實驗靈敏度和檢出限評價實驗可報告范圍評價實驗參考區間的建立與驗證檢測系統的分析性能檢測系統檢測系統：完成一個檢驗項目所需要的儀器、試劑、校準品、質控品、檢驗程序和保養程序等的組合。配套檢測系統（性能驗證）自建檢測系統（性能確認）檢測系統的分析性能指標精密度/不精密度/重復性/重現性正確度/不正確度/偏倚（移）/偏差準確度/不準確度/總誤差線性范圍/可報告范圍/分析測量范圍/臨床可報告范圍分析靈敏度/檢測限/臨界值分析特異性/分析干擾參考值/參考范圍/參考區間/參考限攜帶污染/穩定性ISO15189對檢測系統的要求5.5.1如果使用自建檢測系統，應有程序評估并確認正確度、精密度、可報告范圍、生物參考區間等分析性能,并符合預期用途。5.5.2檢驗方法和程序的分析性能驗證內容至少應包括正確度、精密度和可報告范圍。5.5.5生物參考區間評審內容應包括：參考區間來源、檢測系統一致性、參考人群適用性等，評審應有臨床醫生參加。臨床需要時，宜根據性別、年齡等劃分參考區間。如果建立參考區間，樣本數量應≥120例，若分組，每組的樣本數量應≥120例。驗證參考區間時，樣本數量應≥20例。精密度評價實驗EP5-A2：EvaluationofPrecisionPerformanceofClinicalChemistryDevices;ApprovedGuideline-SecondEdition，2004EP15-A.UserDemonstrationofPerformanceforPrecisionandAccuracy,2001EP15-A2.UserVerificationofPerformanceforPrecisionandTrueness,2005實驗基本要求試驗樣品一定要穩定，要嚴格控制凍融、混勻的操作。至少做正常和病理2個水平的精密度實驗。盡可能在可報告范圍內做高、中、低3個水平。實驗樣品的分析物含量應盡量與公司對檢測系統性能評估時采用的含量一致，便于比較。實驗時按廠商操作規程要求做好校準，并且一定要和實驗樣品一起做質量控制。精密度評價實驗方法CLSIEP5-A2.Evaluationofprecisionperformanceofquantitativemeasurementmethods.2004.2×2×20實驗方案，主要適用于廠商和實驗方法的研究和開發者1×20實驗方案，可用于臨床實驗室，反映的是室內精密即總精密度CLSIEP15-A2.UserVerificationofperformanceforprecisionandTrueness.2005.1×3×5實驗方案，主要用于驗證廠商的性能，也可與質量目標進行比較EP5-A2實驗方案儀器熟悉階段方法熟悉階段（正式實驗開始）初步的精密度評價后續實驗階段（正式實驗）數據收集與整理統計學處理，得出結論

EP5-A2實驗方案實驗數據的收集、處理與統計分析批內精密度（重復性）/RepeatabilityEstimate批間精密度/estimateofbetween-runstandarddeviation.日間精密度/estimateofbetween-daystandarddeviation.室內精密度（總精密度）/estimateofwithin-deviceorwithin-laboratoryprecision與制造商性能要求或其他性能標準的比較重復性比較（批內）精密度評價的比較（室內）確定性能目標（廠商聲明）熟悉儀器、操作者培訓、樣品制備確定重復測定次數和實驗周期樣品檢測：重復測定3次，連續5天記錄實驗數據計算批內和總的不精密度精密度的估計值與廠商聲明比較

核實了廠商聲明的精密度大于計算驗證值，并檢驗

精密度的估計值是否小于驗證值是EP15-A2精密度實驗方案小于聯系廠商尋求幫助否EP15-A2實驗方案舉例廠家聲明：實驗方法：每天分析1個批次，每個濃度重復測定4次，連續5天。實驗數據：重復次數第1批第2批第3批第4批第5批X1140138143143142X2140139144143143X3140138144143141X4139137144143142EP15-A2實驗方案舉例統計學處理計算總均值：計算批內標準差：計算總的標準差：EP15-A2實驗方案舉例與廠商聲明的性能的比較批內精密度：批內精密度與廠商聲明的性能一致。總精密度：計算驗證值并與s總比較：驗證值：結論：總精密度符合廠商聲明的性能。正確度評價實驗EP9-A2：MethodComparisonandBiasEstimationUsingPatientSamples;ApprovedGuideline-SecondEdition，2002UserVerificationofPerformanceforPrecisionandTrueness,2005方法學比較實驗基本要求熟悉檢測系統的檢測、校準和保養程序及評價方案。在整個實驗中，保持實驗方法和比較方法都處于完整的質量控制之下，始終對實驗結果有校準措施。盡可能使50%的實驗標本分析物的含量不在參考區間內，分析物含量盡可能覆蓋分析測量范圍。不要使用對任一方法有干擾的標本。每份標本應有足夠的量，以便使實驗方法和比較方法都能做雙份測定。在2個小時內兩種方法對同批標本分別開始實驗，最好使用當天采集的標本。干化學和常規化學分析原理不同的檢驗項目，原則不進行比對。比較方法實驗室當前使用的方法/檢測系統，生產廠家聲明的方法和公認的參考方法都可作為比較方法。如果比較方法是參考方法，新方法和比較方法間測定的差值稱偏倚；如果比較方法不是參考方法，兩方法間測定差值不能作為偏倚而僅僅是差異。比較方法應該做到如下幾點：具有比實驗方法更好的精密度；不受已知干擾物質的干擾；使用與待評方法相同的單位；可溯源或與參考系統有已知的相對偏倚；參加PT或EQA結果滿意。正確度評價實驗方法CLSIEP9-A2.MethodComparisonandBiasEstimationUsingPatientSamples,20028×2×5實驗方案，主要適用于廠商和實驗方法的研究和開發者CLSIEP15-A2.UserVerificationofperformanceforprecisionandTrueness.2005.3×5實驗方案，主要用于驗證確認廠商的性能，測量均值的偏差與可接受的性能標準進行比較，當偏倚＞性能標準時應計算偏倚的驗證值。定值參考物質檢測的回收實驗熟悉儀器，樣本制備，檢測數據收集同一方法內重復測定值的離群值檢驗繪制Y-X散點圖和（Y-X）-X偏差圖目測線性檢查目測方法間的離群值檢查足夠分布范圍檢查計算回歸方程目測散點圖的一致性檢查使用線性回歸程序計算平均和最大偏倚的估計值并與廠商聲明的性能或內部標準比較若可能，刪除非線性點剩余的范圍是否足夠調查增加數據，延伸分布范圍使用部分偏倚程序使用部分殘差程序調查是否不好是不好超過一個離群值r2＜0.95否好少于一個離群值r2≥0.95EP9-A2方法學比對實驗流程EP15-A2實驗方案應貯存收集的標本直至有足夠的標本量。收集20份病人標本，其濃度應分布整個線性范圍，不要使用超出線性范圍的標本用實驗方法和比對方法分別檢測這20份標本。可在同一天測定完20個標本；也可持續3至4天，每天測定5至7個標本。每種分析方法都應在4小時內完成，如果是貯存的標本應在復融后1到2個小時內測完。每種方法都應有質控程序保障。任何一批因為質控或操作困難而被拒絕，應在問題糾正后重測該批標本。熟悉儀器，樣本制備，檢測數據收集

計算每個樣本兩種方法間結果的差值

繪制（Y-X）-X偏倚或百分偏倚圖檢查偏倚在檢測的濃度范圍內是否一致計算兩種方法間的平均偏倚

計算偏倚或百分偏倚的標準差

與廠商聲明的性能或內部標準比較核實了廠商聲明的偏倚

一致小于大于計算偏倚和偏倚百分比的驗證限，并檢驗

估計偏倚或偏倚百分比是否在驗證限內是將數據分割成幾部分，每部分獨立計算平均偏倚否EP15-A2兩種方法結果的比較

數據收集與處理聯系廠商尋求幫助否EP15-A2實驗方案實驗數據記錄表實驗方法比較方法7677－1－3.512.25－1.30－3.6613.3912712163.512.254.962.606.75256262－6－8.572.25－2.29－4.6521.63……………………292541.52.2516.0013.64186.0221320496.542.254.412.054.2143643152.56.251.16－1.201.44求和5035747.22346.08假設一種血清葡萄糖測定方法的允許偏倚為2.00mg/dL實驗數據處理一、計算每個標本兩種方法間結果的差值二、計算兩種方法的平均偏倚三、點畫偏倚和百分比偏倚圖實驗數據處理實驗數據處理四、計算偏倚和百分偏倚的標準差五、偏倚與可接受性能標準的比較

兩種方法的檢驗結果一致實驗數據處理定值參考物質檢測的回收實驗有證參考物質（CRMs）：已用參考方法或決定性方法定值，可從美國國家標準局（NIST）或其他國際組織認可的提供者獲得。從能力驗證試驗（PT）中獲得的參考物：如CAP和衛生部檢驗中心能力驗證試驗中提供的調查品。廠商提供的正確度確認物或質控物。室間質量評價計劃中使用的質控物。由第三方提供的已用不同方法定值的物質。計算定值參考物質的標準誤實驗程序選擇適合該方法最易獲得的材料。最少要求測定2個水平，選擇的濃度應盡可能代表該方法測量范圍的低值和高值。選擇重要的醫學決定水平濃度也非常有用。注意在選擇的濃度水平該測量程序應有較好的精密度。準備實驗樣品。每一分析物分3~5批測定，每一樣品重復測定2次。計算每一濃度試驗結果的均值（）和標準差（）。實驗示例定值參考物質檢測回收實驗記錄表日期操作者分析批重復次數3/20ZXM批1重復137-0.70.49重復2380.30.093/21WWJ批1重復1391.31.69重復237-0.70.493/22WDM批1重復1380.30.09重復236-1.72.893/23PJL批1重復1391.31.69重復2380.30.093/24WJY批1重復1380.30.09重復237-0.70.49EQA：135家實驗室，血糖均值40，標準差1.73mg/dL可接受性判斷定值參考物質的檢測

以化學發光免疫法檢測AFP為例，采用以下兩種形式來進行正確度驗證：對校準品進行檢測，檢測結果與儀器說明書的“標示值”進行比對。對衛生部檢驗中心2006年10月發放的5份室間控制品進行檢測，檢測結果與“靶值”的偏倚為2.8%-11.9%，均在可接受范圍內。校準品驗證結果（ng/ml）批號靶值驗證值絕對偏差相對偏差(%）D495.295.500.214.0216.0216.20.20.1D475.965.70-0.264.4227.0221.5-5.52.4室間質評控制品驗證結果（ng/ml）批號靶值允許范圍回報值驗證值偏差（%）20062111.88.2~15.412.413.211.920062220.415.2~25.621.019.7-3.420062348.237.2~58.848.846.7-3.12006245.62.7~8.55.35.95.420062549.737.8~61.648.151.12.8靈敏度和檢出限評價實驗EP17-A：ProtocolsforDeterminationofLimitsofDetectionandLimitsofQuantitation;ApprovedGuideline，2004靈敏度和檢出限靈敏度：校準曲線的斜率，即對于規定量的變化分析程序產生信號的變化。檢測限：分析程序具有適當的確定檢出的分析物的最小濃度或量。IUPAC規定的檢出限公式：

LoD=（k×B）/SB為空白信號的標準差。空白指與待測樣品組成完全一致但不含待測組分的樣品，通常通過至少20次重復測定求出。S（靈敏度sensitivity）為分析校準曲線在低濃度范圍內的斜率。k為根據所需的置信度選定的常數，IUPAC建議取k=3作為LoD計算標準。圖1三種分析方法的靈敏度比較檢測限的表示方法檢測低限生物檢測限功能靈敏度空白限檢測限定量檢測限Lowerlimitofdetection,LLDBiologiclimitofdetection,BLDFunctionalsensitivity,FSLimitofblank,LoB

Limitofdetection,LoDLimitofquantitation，LoQ

檢測限評價實驗要求若實驗室嚴格按照廠商說明書進行操作，則僅需要驗證廠商聲明的檢測限或分析靈敏度與此有關的檢驗項目主要包括：①治療藥物；②類似于TSH的免疫類檢驗項目；③心臟標志物如肌鈣蛋白和BNP/NT-proBNP；④PSA和其他的腫瘤標志物等。對諸如血糖、膽固醇、酶類和其他可以用參考區間解釋檢驗結果的項目，對檢測限的驗證并不重要。檢測低限和空白限臨床檢驗中均需要做空白檢測，單次檢測的空白響應量有95%的可能性為：樣品單次檢測可以達到的非空白檢測響應量對應的分析物量即為檢測低限（LLD）。通常分析生理鹽水、蒸餾水或“0”濃度校準品至少10次；計算均值、標準差，2倍（95%）或3倍標準差（99%）即為檢測低限。EP17-A：第95百分位數對應的值（非正態分布），或（正態分布）。XBXB-2SBXB+2SB樣品檢測響應信號無分析物有分析物檢測低限檢測限評價實驗生物檢測限和檢出限某樣品單次檢測可能具有的最小響應量剛大于檢測低限響應量，該樣品內含有的分析濃度為生物檢測限（BLD）。生物檢測限的具體度量方式為：EP-17A：檢出限XBXB-2SBXB+2SB檢測低限123XU-2SUXU+2SUXU生物檢測限檢測限評價實驗EP17-A：空白限（LoB）和檢出限（LoD）0.0010.0100.1001.00001020304050功能靈敏度TSH平均濃度（mIU/L）CV%檢測限評價實驗確定LoB和LoD的實驗設計樣本數在建立一個新方法的LoD時，空白樣本和低濃度樣本均要求至少60個測試數。在驗證廠商聲明的LoD時，在聲明的水平最少測試20個結果，如果有必要，同樣對LoB最少測試20個結果。樣本特性為了確保測試具有代表性，一般用5個或更多樣本，并在幾天測定。驗證廠商聲明的性能，實驗時間段不必包括試劑批號和主要儀器維護的變化；對建立檢測限，要求時間段必須包括試劑批號的變化。實驗設計空白樣本要求其基質盡可能與實際樣本相同或接近，對于內源性化合物，空白應該是去除相應成份的樣本，如通過抗體沉淀，酶的降解，活性炭的吸收等；對腫瘤標志物，樣本應可能來源于無病個體。低值樣本要求最好用一組低濃度樣本，如5個樣本每個測定12次，分幾天測定，這樣混合標準差（SDS）反應的是總的分析變異。為了使LoB和LoD的評價更有意義，測定值應盡可能溯源到SI或參考系統。確定LoB的程序推存最少進行60個空白測定。如果數據呈正態分布,用參數程序評估：

LoB=B＋1.645B如果呈非正態分布，用非參數程序。測量值按由小到大排序，計算第95個百分位數對應的值，即：p=(100-α)=95

LoB=[NB（p/100）+0.5]秩的結果

=[0.95*NB+0.5]秩的結果（NB為空白樣品的數量）確定LoD的程序選擇濃度范圍1~4倍LoB的低濃度樣本4-6個，至少不小于60個結果。若數據呈正態分布，計算這些低濃度樣本精密度的混合估計值（SDs）。計算LoD：

Cβ是標準正態分布95%位數校正因子

確定LoD的程序如果數據不呈正態分布，采用非參數方法計算非參數的估計值，即從測量的β百分位數到低濃度樣本的中位數之間的間距計算非參數估計值，這個間距被稱為DS,β。

可報告范圍評價實驗EP6-A：EvaluationoftheLinearityofQuantitativeAnalyticalMethods;ApprovedGuideline，2003可報告范圍可報告范圍（reportablerange）指可以準確報告的所有結果范圍。包含兩種類型的范圍，即分析測量范圍（analyticalmeasurementrange，AMR）和臨床可報告范圍（clinicalreportablerange，CRR）。AMR：指對沒有進行任何預處理，包括稀釋，濃縮等的標本，分析方法能夠直接測定出的待測物的范圍。常用線性實驗來評價試驗方法的分析測量范圍。CRR：是指對臨床診斷、治療有意義的待測物濃度范圍。此范圍如果超出了AMR，可將標本通過稀釋、濃縮等預處理使待測物濃度處于分析測量范圍內進行測定。HCG

AMR：3-1000mIU/mL，CRR：5-100000mIU/mL

分析結果<3,3,or4mIU/mL，報告<5mIU/mL

分析結果>1000，樣本稀釋分析結果>100000，報告>100000mIU/mLAST

AMR：4-900IU/L

低濃度無意義，分析結果<4，報告<4

分析結果>900，稀釋到測定范圍，乘稀釋倍數

AMR和CRR應用舉例分析測量范圍—線性范圍線性范圍：分析物的濃度或活性值與檢測系統響應量之間成線性比例關系的范圍。分析測量范圍：通過線性實驗來驗證廠商聲明的線性范圍（二點校準）或測量范圍（多點校準）。？？？分析測量范圍上限設定點0點測量信號指定值兩點校準示意圖分析測量范圍上限報告值指定值

線性實驗示意圖多點校準示意圖設定值測量信號？？？分析測量范圍上限分析測量范圍線性實驗示意圖標準值觀察值EP6-A多項式線性評價實驗方法制備線性樣本：通常選擇一個高濃度樣本和一個零濃度（或極低濃度）樣本通過倍比稀釋獲得，從低濃度到高濃度依次為1號樣本、2號樣本，……。濃度范圍覆蓋廠商聲明的線性范圍或分析測量范圍。文件要求驗證廠商聲明不低于5個濃度的樣本，但在實際工作中選擇9個更方便，便于找出非線性部分的拐點。每個濃度重復測定不低于2次，以判斷方法的精密度是否符合要求。以樣本號為橫座標，測定值的均值為縱座標作圖，目測數據的分布情況。利用多項式回歸方法進行線性評價。EP6-A多項式線性評價

數據擬合判斷精密度判斷線性多項式線性評價數據擬合將一系列已知濃度的線性樣本進行測定將測定的數據擬合為一次多項式Y=(a+bx)直線、二次多項式Y=(a+bx+cx2)、三次多項式Y=(a+bx+cx2+dx3)判斷各項系數與0之間的差異是否具有統計學意義，求得臨床可接受的最佳擬合