生物工藝學試題庫

試題庫

思考題

1、舉出幾例微生物大規模表達的產品，及其產生菌的特點，

2、工業化菌種的要求，

工業化菌種的要求：1、菌的營養特征。在發酵過程中，要求使用廉價或來源豐

富的培養基。2、菌的生長溫度應選擇溫度高于40度的菌種。

3、菌對所采用的設備和生產過程的適應性

4、菌種的穩定性

5、菌的產物得率和產物在培養液的濃度

6、容易從培養液中回收產物

3、討論:生產抗生素的微生物能不能生產氨基酸，

4、討論:微生物（包括動、植物）可以生產我們所需的一切產品，但是涉及到

工業化生產，對于某一種特定的產品，為何只有特定的微生物才具有大量表達的潛

力，5、自然界分離微生物的一般操作步驟，

6、從環境中分離目的微生物時，為何一定要進行富集富集，

答:富集是一種施加選擇壓力的微生物分離方法，能增加混合菌群中所需菌株的

數量,其原理是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利其他菌株生長的條

件.例如供給特殊的基質或加入某些抑制劑，但應注意的是,所需類型的菌種生長的

結果有時會改變培養基的性質，從而改變選擇壓力，使其他微生物也能生長,通過把

富集培養物接種到新鮮的同一培養基可以重新建立選擇壓力.重復移植幾次后,接種

少量已富集的培養物到固體培養基上,可將占優勢的微生物分離出來.

7、菌種選育分子改造的目的,

8、以目前的研究水平，土壤中能夠培養的微生物大概占總數的多少,什么是

16sRNA同源性分析，

答：1)以目前的研究水平，土壤中能夠培養的微生物大概占總數7O~8O96.

2)rRNA寡核甘酸編目分析：

一種通過分析原核或真核細胞中最穩定的rRNA寡核甘酸序列同源性程度，以確

定不同生物間的親緣關系和進化譜系的方法.

在眾多的生物大分子中，最適合于揭示各類生物親緣關系的是rRNA,尤其是

16SrRNA,不但分子量大小適中，而且信息量大、易于分析。

16S或18SrRNA同源性分析所依據的基本原理是:用一種RNA防水

解rRNA后，可產生一系列寡核甘酸片斷,如果兩種或兩株微生物的親緣關系越

近,則其所產生的寡核甘酸片斷的序列也越近,反之亦然.

9、什么叫自然選育，自然選育在工藝生產中的意義，

10、什么是正突變，什么是負突變,什么是結構類似物，

答:當突變株的生產性狀優于原菌株的突變叫正突變.

當突變株的生產性狀沒有圓菌株優良的突變叫負變.結構與功能相類似的大分

子物子叫結構類似物.

11、什么是誘變育種，常用的誘變劑有哪些，

答:誘變育種是用物理，化學，生物因素人工誘發使菌種發生較高頻率基因突

變從而獲得優良性狀變異菌株的過程。

[1]物理誘變劑:紫外線，快中子，X射線，激光，

[2]化學誘變劑

(1)堿基類似物：2,氨基口票吟，5,漠尿喀咤，8,氮鳥口票吟，8,AGO(2)與堿基反

應的物質：硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，亞硝基胭，亞硝基甲基胭，亞硝基乙基

胭，亞硝酸，氮芥，4,硝基瞳琳1,氧化物，乙烯亞胺，羥胺(3)在DNA分子中插

入或缺失一個或幾個堿基物質：口丫咤類物質，ICR類物質。［3］生物誘變劑:噬菌

體。

12、什么是基因的重組，什么是基因的直接進化,二者有何區別，13、什么是

培養基?發酵培養基的特點和要求，

14、用的碳源有哪些,常用的糖類有哪些，各自有何特點，

常用的碳源有哪些？

糖類油脂有機酸底碳醇還有蛋白質水解物或氨基酸等也可被微生物作為碳

源使用.

常用的糖類有哪些？

葡萄糖糖蜜淀粉糊精等.

各有什么特點？

葡萄糖是最容易利用的碳源，過多時回導致PH下降,影響酶的活性.

糖蜜是微生物發酵培養基價廉物美的碳源，富含糖氮類化合物無機鹽和維生

素等.淀粉糊精被水解成單糖后再利用，被普遍使用，價格低廉,克服葡萄糖代謝過

快缺點.

15、什么是生理性酸性物質，什么是生理性堿性物質，

16、常用的無機氮源和有機氮源有哪些,有機氮源在發酵培養基中的作用，

17、什么是前體，前體添加的方式，

18、什么是生長因子，生長因子的來源，

19、什么是產物促進劑，產物促進劑舉例，

20、什么是理論轉化率,什么是實際轉化率，

21、培養基設計的一般步驟，

22、培養基成分選擇考慮的問題，

讀書報告:舉例說明培養基設計的方法與步驟，23、

培養基設計的一般原則為選擇適宜的營養物質，營養物質濃度及配比合適，物

理化學條件適宜包括PH值、水活度以及氧化還原電位等條件，還要考慮到經濟節

約。賴氨酸發酵生產中，在產生最大經濟效益的前提下，利用廉價的玉米漿作為碳

源，玉米淀粉水解后產生大量的葡萄糖能夠支持發酵對碳元素的需求；同樣，利用

豆餅水解液作為氮源也能取得理想效果，并且符合經濟效益;加入硫酸鏤作為氮元

素補充并調節PH值。確定培養基成分之后通過影響面分析法確定培養基的最佳成

分配比，并確定對結果有顯著影響的因子，完成實驗設計。

24、討論:培養基優化在發酵優化控制中的作用與地位，

25、么是種子的擴大培養，

種子的擴大培養：將保存在沙土管，冷凍管中的休眠狀態的生產菌種接入試管

斜面活化以后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養而獲得一定數量和質量的

純種過程。26、種子擴大培養的目的與要求，

27、種子擴大培養的一般步驟，

28、在大規模發酵的種子制備過程中，實驗室階段和生產車間階段在培養基

和培養物選擇上各有何特點，

答:在種子制備的實驗室階段,保存在沙土管或冷凍干燥管中的菌種經無菌手續

接入合適的抱子發芽或菌絲生長的斜面培養基中，經培養成熟后挑選菌落正常的抱

子再一次接入試管斜面！

1對于產抱子能力強的及胞子發芽,生長繁殖快的菌種可以采用固體培養基培

養抱子

2對于產抱子能力不強或抱子發育慢的菌種接入含液體培養基的搖瓶中與搖床

上恒溫震蕩培養

3對于不產抱子的細菌采用斜面營養細胞保存法

生產車間種子制備

實驗室制備的泡子或搖瓶菌絲體種子移至種子罐擴大培養，種子罐的培養基雖

因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分，同時還需供給足夠的無菌空氣

并不斷攪拌使菌絲體在培養液中均勻分布，獲得相同的培養條件.

謝謝老師！！！辛苦啦

29、什么是接種量，對于細菌、放線菌及霉菌常用的接種量是多少，30、什

么時發酵級數，發酵級數對發酵有何影響，影響發酵級數的因素有哪些，31、什么

是種齡，事宜種齡確定的依據，

接種齡是指種子罐中培養的菌絲體開始移入下一級種子罐或發酵罐時的培養時

間。通常，接種齡以菌絲體處于生命力極其旺盛的對數生長期，且培養液中菌體

量還未達到最高峰時，較為合適。不同品種或同一品種的工藝條件不同，其接種齡

是不一樣的，一般要經過多次試驗，考察其在發酵罐中的生長能力來確定最適的接

種齡。

32、讀書報告:結合具體的產品理解種子質量控制的方法，以及認識種子質量

對發酵的影響，

33、接種、倒種、雙種，

34、么是菌體的生長比速，產物的形成比速，基質的消耗比速，維持消耗，答；

將菌體濃度的自然對數與時間作圖可得一直線,其斜率為群體的生長比速.

產物的生成比速;第一種情況是產物的生成與細胞的生長有關,則Qp=au

第二種情況是產物的生成與細胞的生長部分有關,則Qp=au+b

第三種情況是產物的生成與細胞的生長不相關,則dP/dt=Qp(u)X

基質的生長比速;無產物生成是,Qs=m+u/YG

隨著細胞生長有產物生成,則Qs=m+u/Y'G

當有產物生成，則Qs-Qp/Yp=m+u/Y'G

?Sm是用于產生能量供維持代謝所消耗的碳源部分。？Sg是用于產生能量供細

胞生長所需的部分。？Sa是用于同化作用構成細胞成分的部分。？Sp是用于形成產

物的部分。

35、什么是Monod方程其使用條件如何,各參數的意義與求解，

36、什么是初級代謝產物，什么是次級代謝產物，

初級代謝產物：自然界中各種生物常能通過一些相同的代謝過程,合成（合成代

謝）或利用（分解代謝）細胞生長和繁殖所必需的化合物.這一過程稱為初級代謝,這

一過程所產生的化合物稱為初級代謝產物.如糖,氨基酸，脂肪酸,核甘酸以及由這些

化合物聚合而成的高分子化合物（如多糖,蛋白質，脂類和核酸等）.次級代謝產物：

是指某些微生物生長到穩定期前后，以結構簡單，代謝途徑明確,產量較大的初級代

謝產物作前體,通過復雜的次生代謝途徑所合成的各種結構復雜的化合物.

38、什么是連續培養,什么是連續培養的稀釋率，

39、解釋連續培養富集微生物的原理，

40、何氧容易成為好氧發酵的限制性因素，

41、比耗氧速度和呼吸強度的感念，

42、臨界飽和溶氧濃度、臨界溶氧濃度、氧飽和度的概念，

43、微生物的臨界溶氧濃度一般多少，發酵過程中的氧容易不容易滿足，臨

界氧是指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度.用空氣飽和度百分數表示.細菌和酵母

為放線菌為5%-30%;霉菌為10%-15%.

發酵過程中氧容易滿足.對于需氧型微生物,應適當增加溶氧水平,可從以下幾

方面考慮：（1）減小加糖或補料速率；（2）降低發酵溫度；（3）液化培養基；（4）中間補

水；（5）添加表面活性劑；（6）在通氣中摻入純氧或富氧.對于掩氧型微生物則應從反

方面考慮適當降低溶氧水平.

44、影響微生物需氧的因素有哪些,

45、發酵液中的體積氧傳遞方程,其中Kia的物理意義是什么，

答：(1)dc/dt=Ka(c*-c)LL

式中dc/dt為單位時間內發酵液溶氧濃度變化，mmolO/(L?h);2

23K為氧傳質系數，m/h;a為比界面面積，m/m;c為氧在水LL

中的飽和濃度，mmol/L;c*為發酵液中的溶氧濃度，mmol/L。

de(2)因為Ka=L(c*,c)dtL

所以Ka的物理意義是:在單位濃度下，單位時間，單位體L

積發酵液中吸收的氧氣量。

46、如何調節搖瓶發酵的供氧水平，

47、如何調節通氣攪拌發酵罐的供氧水平，

48、如何測定發酵液中的溶氧濃度，以及發酵罐的Kia?

49、氧的供需研究與反應器設計與放大的關系，

50、發酵過程中溶氧濃度監控的意義，

答:溶氧(D0)是需氧微生物生長所必須的.在發酵過程中有多方面的限定因素，

而溶氧往往是最易成為控制因素.在工業發酵中,產率是否受氧的限制,單憑通氣量

的大小是難以確定的.因溶氧的高低不僅取決于供氧,通氣攪拌等,還取決于需氧狀

況.故了解溶氧是否夠的最簡便又有效的辦法是就地檢測發酵液中的溶氧濃度.從溶

氧變化的情況可以了解氧的供需規律及其對生長和產物合成的影響〉

51、微生物生長可分為幾個階段,次級代謝產物在什么階段開始合成，

微生物生長可分為延遲期，對數生長期，穩定期，衰亡期；次級代謝產物是從

對數生長末期開始

52、發酵過程的參數檢測有什么意義，生產中主要檢測到參數有哪些，53、

發酵過程糖代謝、氮代謝有什么規律，為什么,

54、測定菌的生長采取哪些方法，不同種的微生物各采取什么方法合適，55、

抗生素、觸的單位的定義

56、抗生素效價的測定可采用哪幾種方法，

57、生物法測定抗生素效價有什么優點，

58、高濃度磷抑制刺激代謝產物合成的機理是什么，

答:磷在代謝途徑的調節方面起著很重要的作用，磷有利于糖代謝進行，能促

進微生物生長。磷過量時，許多產物的合成受到抑制。例如在谷氨酸的合成中，磷

濃度過高就會抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，使菌體生長旺盛，而谷氨酸的產

量卻很低，代謝向繳氨酸方向轉化。但也有一些產物要求磷酸鹽濃度高些。如黑曲

霉NRRL330菌種生產a-淀粉醐時若加入0.2%磷酸二氫鉀則活力可比低磷酸鹽提

高3倍。還有報道用地衣桿菌生產a-淀粉醵時，添加超過菌體生長所需要的磷酸

鹽濃度則能顯著增加a-淀粉酶的產量。

59、發酵過程為什么要補料，補些什么，

答:補料的作用是及時供給菌合成產物的需要，以克服由于養分的不足，導致

發酵過早的結束，提高菌體產量。

補料主要補碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水分。

60、補料過多或過少對發酵有什么影響，

61、準確判斷發酵終點有什么好處,依據哪些參數來判斷，

62、發酵過程中pH會不會發生變化為什么，

+答:在發酵過程中，pH是會發生變化的。這與微生物的活動有關。NH在溶液

中以NH的形式存在。在34

++++++被利用成為R,NH后在培養基內生成H;如以N0為氮源，H被消耗，N0還

原為R,NH;如以氨基3333

+酸作為氮源，被利用后產生的H,使pH下降。Ph改變的另一個原因是有機

酸，如乳酸、丙酮酸或乙酸的積累。

63、pH對發酵的影響表現在哪些方面，

64、為了確定發酵的最佳pH,我們該如何實驗，

65、發酵過程的pH控制可以采取哪些措施，

66、根據微生物對溫度的依賴可分類成哪兒類微生物，

67、微生物對溫度要求不同的原理是什么，

68、發酵過程的溫度會不會變化，為什么

69、發酵熱的定義

70、生物熱的大小與哪些因素有關，

71、溫度對發酵有哪些影響，

溫度是保證酶活性的重要條件，故在發酵過程中必須保證最適宜的溫度環境

一、溫度對微生物生長的影響，、不同的微生物，其最適生長溫度和耐受溫度范圍

各異超過最適的生長溫度.溫度也影響碳,能源基質轉化為細胞的得率（其細胞得率

隨溫度升高而降低，主要原因是維持生命活動的能量需求增加（最大轉化率所處的

溫度一般略低與最適生長溫度（溫度也影響細胞的各種代謝過程，生物大分子的組

分，如比生長速率隨溫度的上升而增大，細胞中的RNA和蛋白質的比例也隨著增長

（幾乎所有的微生物的脂質成分均隨生長溫度變化（溫度降低時細胞脂質的不飽和脂

肪酸含量增加（二、溫度對發酵的影響，一般發酵溫度升高酶反應速率增大生長代

謝加快，生產期提前。但酶本身很易因過熱而失去活性，表現在菌體容易衰老，發

酵周期縮短，最終影響產量。溫度除了直接影響過程的各種反應速率外，還通過改

變發酵液的物理性質間接影響產物的合成。，、溫度還會影響生物合成的方向。例

如四環素發酵中金色鏈霉素菌同時能產生金霉素，再低于,，？,下，合成金霉素的能

力較強。合成四環素的比例隨溫度的升高而增大，在,，？，下只產生四環素。，、溫

度對代謝有調節作用。三、最適溫度的選擇整個發酵周期內僅選用一個最適溫度不

一定好，因適合菌生長的溫度不一定適合產物的合成。溫度的選擇還應參考其他發

酵條件。

72、發酵過程溫度的選擇有什么依據，

73、染菌對發酵有什么危害，對提煉有什么危害，

74、有哪些原因會引起染菌，

75、染菌以后應采取什么措施，

76、為什么會感染噬菌體,感染了噬菌體后應采取哪些措施，

答:從技術上分析，雜菌的途徑有以下幾方面:種子包括進罐前菌種室階段出問

題;培養基的配制和滅菌不徹底;設備上特別是空氣除菌不徹底和過程控制操作上的

疏忽。

遇到早期染菌，原則上可適當改變生長參數，是有利于生產菌而不利于雜菌的

生長;加入某些抑制雜菌的化合物也不失為一種應急辦法;中后期染菌除非是噬菌體

通常后果不會那么嚴重。

答、感染噬菌體的原因：

1(生產菌株本身可能就是帶有前噬菌體的污染菌，在發酵過程，如遇到某

些條件個別菌體就會自發的進入裂解性生活周期，而產生噬菌體。

2(發酵液中存在噬菌體，究其來源有：

(1)含有噬菌體的發酵罐會通過排氣、測樣廢液、洗罐污水或偶爾的“跑

液”等大量散布噬菌體，污染發酵環境和生產系統的各環節。

(2)濾過裝置不良、失效或處理不確實，并在環境中有噬菌體的情況下造

成污染。

(3)操作人員導致的污染。通過工作人員沾有噬菌體的手、工作服及所用

器具導致噬菌體污染。

（4）有時因噬菌體變異，使原本抗噬菌體的菌株變成敏感菌株，導致新的

污染。

如已感染噬菌體可采用以下措施：

1）選育抗性菌株，及時改用抗噬菌體的生產菌株。

2）輪換使用專一性不同的菌株。

3）加化學藥物（如谷氨酸發酵可加2-4ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸鈉，0.6%檸檬

酸鈉或鏤等）。

4）將培養液重新滅菌再接種（噬菌體不耐熱，70-80?經5分鐘即可殺死）（,

5）盡快提取成品

6）其他方法。如谷氨酸發酵在初期感染噬茵體，可以利用噬菌體只能在生長階

段的細胞（即幼齡細胞）中繁殖的特點，將發酵正常并已培養了16~18小時（此時菌

體己生長好并肯定不染菌）的發酵液加入感染噬菌體的發酵液中，以等體積混合后

再分開發酵。實踐證明，在谷氨酸發酵中，采用這個方法可獲得較好的效果。

77、泡沫對發酵有哪些有益之處，哪些有害之處，

78、發酵中泡沫形成的原因是什么，

79、沒有外界作用力泡沫是否穩定,在什么條件下泡沫會穩定，

80、羅氏假說對泡沫穩定的條件作了如何假釋，

81、植物油的消泡機理是什么，

消泡劑作用機理有a、消泡劑可使泡沫液局部表面張力降低，因而導致泡沫破

滅b、消泡劑能破壞膜彈性而導致氣泡破滅

C、消泡劑能促使液膜排液，因而導致氣泡破滅d羅氏假說

消泡劑根據其作用機理的不同可以分為破泡劑和抑泡劑

植物油屬于天然油脂是一種破泡劑.天然油脂它來源容易，價格低，使用簡

單，一般來說沒有明顯副作用，如豆油、菜油、魚油等。油脂主要成分是高級脂肪

酸酯和高級一元醇酯，還有高級醇、高級煌等。

其破消泡機理大致有二種。第一，吸附助泡劑，加入電解質，瓦解雙電層，及

使助泡物被增溶等機理，這樣就破壞助泡物的穩泡作用。在這些過程中消泡劑發揮

一次消泡作用就被消耗。同時消耗掉相應的助泡物。第二，低級醇等溶解性較大的

消泡劑，加到氣泡液中局部降低表面張力，發揮破泡作用，同時本身不斷破為碎

塊，陸續溶解而失去破泡作用。破泡過程中，破泡劑不斷失效、消耗，而助泡劑卻

不受影響

82、對消泡劑有哪些要求，

83、常用的消泡劑有哪幾類，

84、對于黏稠的發酵液應選怎樣的消泡劑，對于較稀的發酵液應選怎樣的消

泡劑，85、用于在線檢測的傳感器必須符合哪些要求，

答:一些在線生物傳感器和基于酶的傳感器所具有的高度專一性和敏感性有可

能滿足在線檢測這些基質的要求另外還有滅菌、穩定性和可靠性問題.

有些可以用于測量值和控制的狀態變量并且現在可以用計算機監控系統。

86、pH電極的指示電極能測定pH值的原理是什么，

87、pH電極的測量范圍有沒有限制，使用時應注意哪些問題，

88、溶氧電極能夠測定液體中溶氧濃度的原理是什么，

答：溶氧電極可分為極譜型和原電池型。

現在國內外測定溶液中的溶解氧基本上用極譜型的復膜氧電極。

陰極由伯、銀、金等貴金屬組成，陽極由鉛、錫、鋁等組成。當給電極施加

極譜電壓（0.6~0.8V負電壓）時，溶液中的氧就在陰極被還原。當產生的電流與溶

液中氧含量成正比時，此時的電極電流為飽和電流，此時的電壓為極譜電壓。氧濃

度與飽和電流成正比關系。

89、影響溶氧電極測定的靈敏度和準確性的因素有哪些，

答：1.壓力和溫度的影響:溶氧電極必須經得起高壓蒸汽滅菌，如能耐130攝氏

度，1小時滅菌和具有長期的穩定性，其漂移不大于1%/d,其精確度和準確度在

+3%。

2.原電池型電極電流輸出受電極表面液流的影響。

3.用溶氧電極測定呼吸臨界氧值時，過程中先加強通氣攪拌，使溶氧上升到最

高值，然后中止通氣，繼續攪拌，在灌頂部空間充氮。這時溶氧會迅速直線下降，

直到其直線斜率開始減少時所處的溶氧值便是呼吸臨界氧值。

90、哪些儀器可以測定尾氣氧和尾氣二氧化碳,測定原理是什么，

答：

尾氣CO的測量2

常用的尾氣測定儀是不分光紅外線二氧化碳測定儀（簡稱IR）,其精度高，可

達?0.5%,量程的線性范圍大，雖然儀器價格高，但在生物細胞培養時常被采用。

不分光紅外線C02氣體分析原理是:除了單原子氣體（如嵐、氮等）和無極性的雙原

子氣體（如氧、氫、氮等）外，幾乎所有氣體都在紅外波段（即微米級）具有不同的紅

外吸收光譜，CO的紅外吸收2峰在2.6~2.911m和4.r4.5um之間有兩個吸收

峰，根據吸收峰值可以求出CO的所含濃2度。

尾氣氧氣測定

原理是氧具有高順磁性。在磁場中，氧氣的磁化率比其采用熱磁氧分析儀測定

它氣體高幾百倍，故混合氣體的磁化率幾乎完全取決于含氧氣的多少。將排氣通入

熱磁氧分析儀，就可測出排氣氧的含量。

91、利用基因工程菌生產，有什么優勢，常用的宿主菌有哪些,

92、利用基因工程菌生產有哪些特點，

93、重組菌基因不穩定性的原因有哪些，

94、在基因工程菌培養過程中為什么質粒會丟失，

95、基因工程菌高表達的障礙是什么，

96、常規的高密度培養的措施有哪些，

答案：為了提高細胞量和代謝產物產量，可以采用draw-fill式，補料式，半連

續式和連續式培養等。作為工藝過程，一般

可以分為三個階段。

第一個階段是準備階段，包括設備的準備，清洗，消毒，培養基的制備和除

菌，細胞種子的復蘇，檢定和擴增。細胞

培養過程要求高，準備工作費時費力，必須仔細認真，保證高標準，提高成功

率。

第二個階段是細胞培養階段。包括細胞的接種，培養工藝參數的調整，取樣分

析，培養基更換等。配有先進控制功能

的生物反應器是大規模高密度培養的有效手段。

第三個階段是產物產生階段。包括培養基的更換，病毒的準備，接種或產物表

達誘導劑的加入，培養上清液的收獲，

取樣分析等。

具體的高密度培養一般方法有如下五種：

1.分批培養。是將細胞和培養液一次形狀如反應器中進行培養，細胞不斷形

成，產物不斷積累，經過一段時間后將整個

反映系取出。操作簡便但是不能使細胞從始至終在最優條件下生長。

2.流加培養。將一定量的培養液裝入反應器，在適宜條件下接種培養。新營養

成分隨消耗不斷加入，到反應終止后將整

個反映系取出。能夠做到按照培養物的央求培養細胞。

3.半連續培養。又稱反復分批培養或換液培養。在分批培養的基礎上不全部取

出反應系剩余部分重新補充新的營養成分。

再按分批培養的方式進行操作。可以反復收獲培養液。可采用取出部分用過的

培養基和加入新鮮培養基的方法實現細胞足夠

營養及代謝廢物的排除。

4.連續培養。將培養物與培養液一起加入反應器中進行培養。一方面新鮮培養

液不斷加入其中，使細胞維持在優化狀態

下，促進細胞的生長和產物的形成。

5.灌注培養。是細胞接種后進行培養。新鮮培養基加入反應器同時將反應液源

源不斷地去處，但細胞留在反應器內，使細胞出于一種不斷營養的狀態。

97、重組菌與傳統微生物在產物表達上有什么區別，

98、與大腸桿菌相比酵母作為宿主菌有什么優點，

答:釀酒酵母是迄今為止研究最深入的真核生物，它具有比大腸桿菌更完畚的

基因表達調空機制，和更強的對表達產物的加工修飾及分泌能力，因此，釀酒酵母

作為基因工程的表達系統日益得到廣泛的應用，并已成功表達了多種外源基因。

99、重組菌與傳統菌在發酵過程控制中有哪些相同之處，

100、重組大腸桿菌的誘導因子有哪些，重組酵母的誘導因子有哪些，利用某

些微生物能夠不對稱還原4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl4-chloroacetoacetate,COBE)

得到1(+)-4-氯-3羥基丁酸乙酯的特性,從赭色擲抱酵母(Sporobolomyces

salmonicolorZJU0307)中克隆出醛基還原酶(NADP-dependenlAldehyde

reductase)基因，成功地構建了重組大腸桿菌E.coliM15(pQE30-alr0307)。用重

組菌作為催化劑,解決了用常規酵母細胞轉化COBE,產物是部分外消旋的R,S-(+)-

4-氯-3羥基丁酸乙酯,e.e.值較低的問題。利用微生物產酶催化還原COBE獲得

CHBE的過程需要輔酶NADPH參與提供氫原子。由于工程菌E.coli本身與酵母菌不

同,沒有完善的輔酶再生系統，因此往往需要額外添加NADPH和葡萄糖脫氫酣。為

了避免使用這兩種價格昂貴的物質，我們從巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium

ZJU0310)中克隆出6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase)

基因，構建了重組大腸桿菌E.coliM15(pQE30-gdh0310),能夠表達葡萄糖脫氫酶,

將葡萄糖轉化為葡萄糖酸，同時將輔酶NADP+轉化為NAPDHo

101、溫度對微生物影響的原理

微生物生長速率與溫度的相關性

人們常以最適生長溫度、最高生長溫度及最低生長溫度來描述微生物的生長溫

度特性。依微生物的生長溫度，可將微生物分為低溫菌(psychrophiles),中溫菌

(mesophiles)和高溫菌(thermophiles)。低溫菌類的微生物，其最低生長溫度可低

于5oC,中溫菌表示其最適生長溫度為37oC,高溫菌則是指這類微生物的最高生長

溫度可高于50oC。微生物的生長速率會受到外界環境溫度的影響，當微生物處于

不適當的生長溫度時，其因應方法有若此微生物具有移動性，它可以利用本身所具

有的溫度向性(thermotaxis)能力離開不是溫度的生長環境;或微生物可忍受此環

境的溫度，且能在此溫度對微生物生長產生的影響所容許的程度下，持續進行菌體

的分裂生長;或若此微生物能進行產抱等類似分化的過程，則可藉此一對外界不

利生長因子具有較高耐受性的狀態度過環境溫度不適生長的時期，唯微生物分

裂生長的速率將暫時停止或大為降低。在自然界中的確有些微生物能在高于100

oC的水中，或低于冰點的環境中生長。環境中的養分與微生物生長的相關性

微生物生長速率受溫度的影響可以利用Arrhenius法則(v=Se-E*/RT)來推

算，當v等于生長速率，S為常數，T為絕對溫度，且E*為活化能時，lnv=S+(-

E*/RT)=S+(-E*/R)(1/T)0但是在一般生長溫度下，微生物的培養環境如實驗室中

所用的各式培養基亦具有影響微生物生長速率的能力。雖然培養環境的條件并不會

改變對微生物的最適生長溫度，但對于不同微生物之最高生長溫度及最低生長溫度

的范圍，則依不同菌種而產生不同的影響。例如當在養分充裕的培養基中培養枯草

桿菌時，枯草桿菌的最低生長溫度會有下降的現象，即枯草桿菌可生長在比一般環

境條件培養所能生長的最低生長溫度更低的溫度下，此外若在培養基中外加如

methionine氨基酸等養分時，則發現大腸桿菌可生長在較一般環境條件培養所能

觀察到的最高生長溫度還高的溫度，亦即可以提高大腸桿菌的最高生長溫度。培養

基的組成成份對最低及最高生長溫度的影響原因之一，可能是因微生物體內的代謝

途徑，特別是某些生合成的途徑，在高溫或低溫時，常有失去功能的情形出現，使

得微生物無法再充分供應自身生理所需的養分，因而無法正成生長或甚至有喪失生

命力的情形。在此時外界環境如培養基等若能補充并提供微生物所缺乏的養分，將

可提高微生物在此溫度下的生存能力。

溫度對微生物組成份及生理的影響

微生物的生長速率包含細胞質量(cellmass)及微生物生長產量(growthyield)

二因子隨時間的變化量，且此二因子皆會隨生長溫度的不同而改變。一般認為決定

微生物最高生長溫度的決定因子為細胞中蛋白質的穩定性，且外界環境溫度對細胞

內蛋白質和細胞膜的脂肪酸成份亦具有影響力。環境溫度對細胞內蛋白質的影響包

含細胞中酵素的活性和酵素的表現量，并會引起微生物的熱休克反應(heatshock

response)o在正常溫度范圍內，中溫菌細胞內酵素的活性會隨著溫度的改變而改

變，但在酵素量上的變化較少;若是溫度較高時，如高于42oC時，細胞中蛋白質

的量則會有相當大的變化，這是因為大部分蛋白質的生合成量隨著溫度的升高而產

生的變化，多為降低細胞中蛋白質的生合成量。

當環境的溫度增高時，微生物會產生熱休克反應，如在大腸桿菌中，已被發現

至少有24種蛋白質會因溫度的升高而大量表現，這些蛋白質被稱為熱休克蛋白

質。在這24種熱休克蛋白質中，則其中至少有20種熱休克蛋白質是受控于一種

sigmafactor,稱為htpR。一般認為微生物的熱休克反應與htpR調控熱休克蛋

白質表現的能力有直接的相關性，而微生物熱休克反應的效率則與微生物是否能于

環境溫度提高時存活有著密切的相關性。研究結果中顯示突然升高培養環境的溫度

時，野生型(wildtype)微生物的存活率，遠較htpR突變菌株(即在htpR基因有

缺陷的微生物)為高，此種熱休克反應被發現廣泛的存在于多種微生物中，且在許

多高等生物中亦相當常見。多種熱休克蛋白質具有特殊的生物活性，能協助其它蛋

白質維持其正確的折迭(folding)形態，而使其它蛋白質具有適當的立體結構，繼

而得以執行正常的功能，所以推測這些熱休克蛋白質可能藉由穩定細胞內其它蛋白

質因溫度升高而松垮的立體結構，使細胞中的蛋白質保有部份或全部的生理功能，

因而讓微生物得以在較高的外界環境溫度下存活。

微生物外在環境溫度對微生物細胞膜的磷脂中飽和性脂肪酸(saturatedfatty

acids)及非飽和性脂肪酸(unsaturatedfattyacids)的比例亦有影響。當外界環

境溫度下降時，非飽和性脂肪酸的比例會隨之增高，而飽和性脂肪酸的比列則會下

降。因為非飽和性脂肪酸含有較飽和性脂肪酸為多的雙鍵，熔點(meltingpoints)

較低，所以在外界環境溫度降低時，細胞膜中非飽和性脂肪酸比例的增加，可能具

有使細胞膜流動性增加;細胞膜正常生理功能得以部份維持的作用。當環境溫度上

升時，細胞膜中非飽和性脂肪酸比例則

有降低的現象，而飽和性脂肪酸比例會增加，相對于環境溫度下降時非飽和性

脂肪酸比列增高的原因，此現象可能與拮抗因環境溫度上升而增加之細胞膜流動性

有關。

當外界環境溫度降低時，對微生物的影響主要還是在細胞中的蛋白質上，因蛋

白質的斥水鍵強度在低溫時有減弱的情形，細胞中蛋白質的立體結構會因之改變，

使得蛋白質酵素與其它分子如一些反應物(effectors)間的作用方式或親和力發生

變化，造成蛋白質的功能及其調控方式與正常環境溫度時不相同，因而影響微生物

在低溫時生理代謝無法正常運作。此外，在低溫時，核醮體蛋白質(ribosomal

proteins)

或蛋白質轉譯啟始蛋白質因子(initiationfactorsoftranslation)無法形

成適當的立體結構，使得裝配核醺體(ribosomes)時效率不佳，而核醵體為微生物

體內轉譯蛋白質的部位，當核醵體裝配情形不良時，氨基酸聚合情形自然不理想，

微生物細胞中蛋白質轉譯生合成的量降低，微生物正常的生理狀況因而無法維持。

微生物的致死溫度

將微生物給與高溫處理或突然間將微生物置于低溫或冷凍狀況下時.，微生物可

能喪失其生長的能力而死亡。微生物因高溫處理而喪失分裂能力的程度與微生物體

內的含水度相關，其因溫度處理而死亡的速率常可以指數動力型的模式進行推測和

評估。一般而言，特定的一些數值常用來描述這些高溫熱處理的有效性，如TDP

(thermaldeathpoint),指的是將微生物以熱處理一特定時間后，使微生物喪失

分裂能力所需的最低溫度;TDT(thermaldeathtime)或是F值，所代表的是在特

定的培養基中，以特定溫度將一特定密度之微生物進行滅菌所需之時間;此外，D

值則指以熱處理將微生物數量減少90%所需的時間。

當微生物處于冷凍低溫的環境時，微生物可能因冷凍而立即死亡，或因儲存效

應而在冷凍低溫儲存期間緩慢失去分裂能力，這和冷凍時細胞的密度和冷凍儲存的

溫度皆有相關性。欲進行菌種保存時，尤其是工業界或學術界須長期保存有價值的

微生物，并維持其存活率、使能多次重復利用時?，一些化學物質如甘油(glycerol)

和dimethylsulfoxide等抗凍劑，常被加入培養基中，這些物質可以保護微生物，

降低微生物因低溫冷凍所受到的傷害。

分離技術習題庫

(-)緒論

1生物產品與普通化工產品分離過程有何不同,

首先，生物產品存在于發酵液中，它是復雜的多相系統，含有產生生物產品的

細胞本身、代謝產物和未用完的培養基等，分散在其中的固體和膠狀物質具有可壓

縮性且其密度與發酵液接近，黏度很大，屬非牛頓性液，所以使得從培養劑中分離

這些固體很難，因此在分離前一般要將發酵液酸化、加熱或加入絮凝劑而進行預處

理，。而普通的生化制品與其周圍物質的質地相差很大，因此更易于分離。

其次，生物物質在培養液中的濃度很低，雜質含量高，因此要從低濃度的混合

液中分離出需要的組分需很大的能量且最后成品需要達到的純度又很高，這又要求

對生物產品應進行多步的純化操作一般分初步純化（提取）；高度純化（精制）和最后

純化。

再次，欲提取的生物物質都不太穩定，遇熱、強酸強堿、有機溶劑、去污

劑、高離子強度等條件都會使其降解或活性降低。因此在生物產品的分離較其他化

工產品的分離比需要更溫和的條件，溫度、PH等各個參數都應在分離前進行優

化，使生物產品在穩定的條件下進行分離。

2傳統生化產品與基因工程產品分離方法的比較，

答案:傳統生化產品與基因工程產品在提取和精制上的差異，主要表現在下列

三個方面：

1）傳統生化產品都是小分子（工業用醵除外，但它們對純度要求不高、提取方

法比較簡單），其理化性能（如平衡關系等）數據都為已知，因此放大比較有根據;相

反基因工程產品大多為大分子，必要數據缺乏，放大多憑經驗。

2）由于第一代基因工程產品都是以大腸桿菌作為宿主，無生物傳遞系統、故產

品處于胞內，提取前需將細胞破碎，胞內物質釋放出來給提取增加了很多困難而發

酵液中的產物，濃度較低，雜質又多，且一般大分子較小分子不穩定（易失活，如

對剪切力），故提取較困難。

3)大分子的分離主要困難在于雜蛋白的分離，由于蛋白質都由氨基酸構成，所

以性質相似，分離主要依靠高分辨力的精制方法，如色層分離等。小分子的分離通

常容易些，但是當雜質和目標物質性質相近時，也需要應用色層分離，例如西索米

星的分離。

2設計生物產品的分離工藝應考慮哪些因素，

答：1)充分利用目標蛋白質和雜蛋白在物理，化學和生物等方面性質的差異，

尤其重要的是表面性質的差異。如表面電荷密度，表面疏水性等。

2)當兒種方法連用時:最好以不同的分離機制為基礎，而且經前一種方法處理

的液體應能適合于作為后一種方法的料液，不必經過脫鹽，濃縮等處理。

3)離子交換層析系根據蛋白質表面所帶電荷不同而分離。分離時應選擇在電荷

相差最大的pH下進行操作。

4)親和層析選擇性最強，但不能放在第一步，以延長介質壽命，降低成本。5)

注意非蛋白類雜質的去除。如DNA,熱原質和病毒。

另一答案:設計生物產品分離工藝是應考慮收率，目標產物的穩定性，溫度、

PH對目標產物活性的影響，成本和生物安全問題等。

(1)收率:生物產品所在的發酵液或培養液的特點之一是含欲提取的生物物質濃

度很低，但雜質含量卻很高。由于雜質較多且成品要求達到的純度較高，常需多步

純化操作，因此應盡可能提高收率，減少提取步驟，不僅能節省時間，還能降低成

本。

(2)目標產物的穩定性:欲提取的生物物質通常很不穩定，遇熱、極端PH、有機

溶劑會引

起失活或分解，特別是Pr的生物活性與一些輔因子、金屬離子的存在和分子

的空間構型有關。設計分離工藝時，應考慮目標產物的物理、化學和生物學活性,

防止其變性失活以至無法利用。

(3)溫度、PH對目標產物活性的影響:溫度過高或過低，強酸或強堿條件會破壞

目標產物尤其是Pr的空間構型和結合鍵，造成目標產物的活性降低甚至失活，故

應充分考慮溫度、PH的作用，盡可能采取最佳方案。

(4)成本:在保證有較高的收率的條件下，較低的成本就成為我們追求的目標。

要求所需原料價格低廉、容易獲取、適用范圍廣、再生能力強、能夠重復利用等。

(5)生物安全問題：即要防止菌體擴散，一般要求在密封的環境下操作。

、除去溶液中的非蛋白雜質。回答：1

2、考慮目的蛋白和雜質蛋白在物理，化學，生物等方面的差異，尤其重要的

是表面

性質的差異。

3、離子交換層析根據蛋白質表面所帶的電荷不同而分離的。分離時應該選擇

在電荷

相差最大的pH下進行操作。

4、親和層析選擇性最強，但不能放在第一步，以提高其使用壽命。

5、幾種方法一起使用時，最好以不同的分離機制為基礎，而且經前一種方法

處理的

液體應能適合于作為后一種方法的料液，且不用經過脫鹽，濃縮等處理。

6、溫度和pH會對目標蛋白的活性產生影響。設計方案時應充分考慮溫度，pH

的作

用。

7、通常提取的目標蛋白很不穩定，熱、極端pH、有機溶劑都會使其失活。設

計方案

時，應考慮產物的物理、化學、生物學活性，防止其變性失活。

8、提取物一般在發酵液中含量很低，但雜質含量卻很高。由于雜質較多且成

品要求

達到的純度高，需要多步純化操作，因此，應盡可能的提高收率，減少提取步

驟。

9、原料的價格便宜、容易收獲、適用范圍廣、再生能力強、能夠重復利用，

以便降

低成本。

10、操作時要在密閉的環境下進行，防止菌體擴散，造成生物污染。

3初步純化與高度純化分離效果有何不同，

答：（D一般說來,下游加工過程可分為四個階段:培養液（發酵液）的預處理和

固液分離;初步純化（提取）；高度純化（精制）；最后純化.

（2）初步純化（提取）

經固液分離或細胞破碎及碎片分離后,活性物質存在于濾液中，濾液體積很大，

濃度很低，

下游加工過程就是濃縮和純化的過程,常需好幾步操作.其中第一步操作最為重

要,稱為初步純化或提取，主要目的在于濃縮,也有一些純化作用，而以后的幾步操作

所處理的體積小,合成為高度純化或精制.

初步純化的主要方法有吸附法,離子交換法,沉淀法,溶劑萃取法,兩水相萃取法,

超臨界流體萃取法,膜過濾法等.

（3）高度純化（精制）

經初步純化后,體積已大大縮小.但純度提高不多，需要進一步進行精制.大分子

（蛋白質）和小分子物質的精制方法有類似之處,但側重點有所不同，大分子物質的精

制依賴于色層分離,，而小分子物質的精制常常利用結晶操作.

（4）綜上所述,初步純化使濾液濃縮,也有一些純化作用.高度純化使濃縮了的濾

液提高濃度.

（王天佐03120381）

4如何除去蛋白質溶液中的熱原質，

答:熱原是腸桿菌科產生的細菌內毒素（脂多糖），從細菌細胞壁產生，注入體

內會使體溫升高，去除困難。傳統的去熱原方法是活性炭吸附或石棉板過濾，但前

者會造成產品損失，后者對勞動保護和產品質量都存在一定問題。當產品分子量在

1000以下，用MWCO為10000的超濾膜除去熱原是很有效的。注射用水和藥劑也可

按此法去熱原。脂多糖是陰離子的可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用

疏水層析法。

答：熱原質是腸桿菌科產生的細菌內毒素，是脂多糖類物質，從細菌的細胞壁

產生，注入體內會使體溫升高，其去除困難。傳統的去熱原方法是活性炭吸附或石

棉板過濾，但全這會造成產品損失，后者對勞動保護和產品質量都存在一定問題。

當產品分子量在1000以下，用MWC0為10000的超濾膜除去熱原是很有效的。注射

用水和藥劑也可按此法去熱原。脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖

是疏水性的可用疏水層析法。答:熱原質：熱原質即細菌細胞壁的脂多糖，主要是腸

桿菌科所產生的細菌內毒素。大多由革蘭陰性菌產生.注入人體或動物體內可引起

發熱反應，故名熱原質，熱原質耐高溫，高壓蒸氣滅菌不能破壞.

1.從蛋白質中除去熱原質比較困難，最好的辦法是防止產生熱原質，整個過

程在無菌條件下進行。所有的層析介質在使用前先除去熱原質，操作在2到8攝氏

度下進行，洗脫液需先經無菌處理，流出的蛋白質也需無菌處理，即通過0.2納米

的微濾膜，并在2到8攝氏度下保存。

2.對于小分子量的多肽或蛋白質可以用超濾或反滲透進行除去。此方法不適用

于大分子蛋白質溶液。

3.對于大分子的蛋白溶液可以用以下方法：

1).用陰離子交換層析法去除，因為脂多糖是陰離子。此時應注意調節PH使蛋

白不被吸附。

2).用疏水交換層析法去除，因為脂多糖中的脂類是疏水性的。

3).還可根據蛋白質和熱原質的親和性的不同用親和層析法去除。配基可用多

黏菌素B,或光譜的抗體等。

在應用上除去熱原質最好辦法是蒸儲

5生物分離為何主張采用集成化技術，

答：因為生物產品在分離和純化過程中需要多個操作步驟,且分離過程中易發生

變化,也需要許多檢查和分析方法.為此一種操作分離技術是遠遠不夠的，需要多種

分離技術同時結合應用。

所以,在實際中，為減少操作步驟,提高產品收率,要把幾個步驟合并，使分離效

果更好，特別是集成化技術的出現為產品分離和高效產率有很大貢獻，例如，擴張

床吸附技術，能取代固液分離濃縮和初步純化三步操作，以使過程大大簡化，且產

品收率得到提高。集成化技術包括操作集成化和方法集成化。集成化的使用禰補丁

單一方法的不足，減少操作步驟，提高產品收率,使生物分離更加快速高效的完

成。所以集成化技術在生物分離上得到廣泛應用。另一答案:隨著生物分離技術的

不斷改進和變化，隨著DNA重組技術的發展，新的蛋白質和新的分離方法也不斷出

現，采用繼承化技術是一種必然。

首先，生物分離的步驟比較復雜，大致講主要包括以下幾步：

第一部分為固-液分離，第二部分為初步純化，第三部分為高度純化，第四部

分為成品加工。具體內容有生物產品的細胞破碎，沉淀，過濾，離心，萃取，膜分

離，吸附與離子交換，層析，親和純化，電泳，結晶及干燥等。大家都知道，操作

步驟越復雜，生物產品的收率越低，因此在操作上采用集成化，不僅能提高產品收

率，而且還降低了生產的成本，這無疑是非常具有吸引力的。

其次，生物產品分離需要的條件復雜，人工控制難以達到理想的效果或者工作

兩非常巨大，所以采用繼承化技術便于自動化控制，效果非常明顯。

再次，許多生物產品在單個細胞中含量很底，小規模的培養收效過低，采用集

成化技術，便于生物產品的分離純化。同樣，由于其生物制劑的特殊性，單一的分

離純化手段很難達到目的，因此在分離純化方法上也需要集成化。例如將親和作用

力與膜分離結合起來，利用前者的高選擇性和后者的高處理能力優點，彌補了親和

層析的處理量小和膜分離選擇性差的缺點，折中方法稱為親和膜分離。現在這方面

發展很多，也在不斷的發展著。另一答案：

鑒于過程集成化技術在化學工業中取得的成功，發展生物過程的集成化技術將

成為解決生物產品產業化技術的重要途徑之一。

過程集成是指將兩個或兩個以上的生產技術或工藝步驟有機地結合在一起，在

一個生產過程或設備中同時完成的先進生產技術。過程集成的目的是簡化工藝流

程、提高生產效率及降低投資和生產成本。無論是化學工程還是生物工程的發展，

都離不開過程集成技術。

生物體系是一個多種反應的集成體系，即使在最簡單的大腸桿菌中也同時發生

著數以千計的反應用于細胞合成和代謝產物的生成;生物體系也是一個反應與傳質

分離的集成體系，各種營養物質要通過細胞壁傳遞到細胞內，一些代謝產物則需要

釋放到胞外以防止在胞內的積累。

在傳統的工業發酵中，產品的制取需要經過酶生產,醵分離,生物大分子的酶水

解，細胞培養，目標產物分離等五個基本步驟:而在基因工程蛋白質的生產中，一般

又包括了酶生產,酶分離,生物大分子的酶水解,基因工程細胞培養,產物的誘導表達,

細胞破碎，產物分離、復性與純化等基本步驟。在工藝流程長、生產效率代的同

時，還可能存在如下的問題:酶生產中的產物或底物抑制:產物或酶分離過程中的失

活;酶水解或細胞生長過程中的產物或底物抑制;細胞破碎中目標產物的損失;各種

分離提純與復性方法的條件匹配和相互

制約等。

生物過程集成化技術就是要將上述反應或分離步驟中幾種不同的方法集成在一

個反應器或一個工藝步驟中進行，這樣既能夠簡化工藝流程、提高生產效率，又可

以解決產物抑制、失活及操作條件的匹配和制約等問題。

生物過程集成化技術是生物產品產業化技術發展的一個方向，加強這一領域的

研究將大大促進生物技術的產業化進程。我國已把發展生物技術作為本世紀的一個

重要任務，而生物技術的產業化是實現生物技術高速發展的最終目的，高速和高效

地將實驗室成果轉化為商品，增強生物技術產業化中的技術含量勢在必行。

6純化生物產品的得率是如何計算的，若每一步純化產物得率為90%,共6步純

化得到符合要求產品，其總收率是多少，

答:?純化后得到的生物物質？欲提取的生物物質總量X100%=得率

?總收率等于每步純化產物的得率的乘積再乘以100樂

6若每一步純化產物得率為90%則總收率：0.9X100%=53%

（二）發酵液的預處理和固液分離

1發酵液為何需要預處理,處理方法有哪些，

答：以發酵液為出發點,要設法將細胞（菌體）富集或去除,使所需目標產物轉移

到液相中，同時還希望除去其他懸浮顆粒（如培養基殘渣菌體或絮凝體等）以及改善

濾液的形狀，以利后續各步操作,所以發酵液要進行預處理.

方法：

（1）過濾和離心

無論胞內還是胞外產物,都要涉及細胞的富集或固體懸浮物的分離除去,常用的

固液分離方法主要是過濾和離心方法.

(2)凝聚和絮凝技術

凝聚和絮凝技術能有效的改變細胞菌體和蛋白質等膠體粒子的分散狀態，使其

聚集起來，增大面積，以便于固液分離,常用于菌體細小而且黏度大的發酵液的預處

理中.

(3)雜蛋白質的其他去除方法

＜1＞等電點沉淀法;＜2＞加熱變性＜3＞利用吸附作用也可以除去蛋白質＜4＞加蛋白

質沉淀劑,使形成復合物沉淀.

(4)高價無機離子的去除方法

＜1＞去除鈣離子,用草酸或草酸鈉.＜2＞去除鎂離子,加入三聚磷酸.〈3＞用磷酸鹽

處理,也能大大地降低鈣離子和鎂離子的濃度.＜4＞要去除鎂離子,可加入黃血鹽，使

形成普魯士藍沉淀.

另一答案:答：

發酵液進行預處理的原因是:發酵液是復雜的多相系統，含有細胞、代謝產物

和未用完的培養基等，分散在其中的固體和膠狀物質，具有可壓縮性，其密度又和

液體相近，加上黏度又大，使得從發酵液中提取固體很困難。預處理的目的就是以

細胞培養液或是發酵液為出發點，設法將細胞(菌體)富集或去除，使所需要的目的

產物轉移到液相中，同時還希望除去其他的懸浮顆粒，以及改善濾液的性狀，以利

后續各步操作。

預處理的方法有：

1凝集和絮凝技術

凝集:在中性鹽的作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩定

的現象。

凝集的原理:與膠粒帶相反電荷的離子，由于能降低6電位和脫除膠粒表面的

水化膜，能導致膠粒間的凝聚作用。常用的凝聚劑電解質有A12604)3?181120

(明磯);A1C13?6H20;FeC13;ZnS04;MgC03等。

絮凝:在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使細胞聚集形成不穩定的

現象。絮凝的原理:高分子絮凝劑上含有相當多的活性基團，它們通過靜電力、范

德華引力或者氫鍵的作用，強烈的吸附在膠粒的表面，一個高分子聚合物的許多鏈

節分別吸附在不同的顆粒上，產生了架橋連接，生成粗大的絮團。常用的絮凝劑是

人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類和聚乙烯亞胺衍生物。

2雜蛋白的其他去除方法

(D等電點沉淀法:在某一PH處，蛋白質的靜電荷為零，溶解度最小，可使其

沉淀而除去。

(2)變性沉淀法:蛋白質從有規則的排列到變成無規則的排列結構稱之為變性，

變性蛋白質的溶解度最小。如熱變性法、大幅度改變PH法，加入有機溶劑及表面

活性劑等。(3)吸附作用

(4)加入蛋白質沉淀劑:使之形成復合物沉淀。

3高價無機離子的去除方法

Ca2+:加入草酸或其可溶性鹽(如草酸鈉)。反應生成的草酸鈣還能促進蛋白質

凝固，提高濾液的質量。應注意草酸的回收問題。

Mg2+:加入三聚磷酸鈉Na5P3010,它和鎂離子形成可溶性絡合物。用磷酸鹽處

理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。

Fe3+:加入黃血鹽，使之形成普魯士藍沉淀。

2如何使用助濾劑？

(1)將助濾劑中加至濾漿中，攪拌均勻后過濾，使助濾劑在過濾介質上形成

多孔、疏松的濾餅，反復過濾以得到澄明溶液。這種方法適合濾漿中固體含量少,

特別是含有粘性或膠凝性物質，助濾劑用量為0.1-0.5%o由于濾渣與助濾劑不容

易分開，若過濾的目的是回收濾渣，就不能把助濾劑與懸浮液混合在一起。

（2）將助濾劑用適量的濾漿制成糊狀物，加至過濾介質上，抽濾使成1-5mm

厚的助濾劑沉積層，然后過濾。這種過濾方法可防止過濾介質孔道被細顆粒或粘著

物堵塞，過濾初期就可得到澄明溶液。也可將（1）、（2）方法聯用。

（03級生物技術4班程志遠03120311）

3凝集與絮凝過程有何區別,如何將兩者結合使用，

4錯流微濾與傳統過濾相比有何優點

錯流微濾可在過濾介質孔徑小于0.4um的范圍內實現一步過濾。錯流微濾的優

點是:減少濃差極化，使用壽命延長,可對固體有近100,的截留率，分離效率高，過

濾效果穩定，有良好的生物物質截留效果，組件設計與操作靈活。能在高濃度溶解

凈化和極端環境（酸、堿、有機溶劑、高

溫、高壓）下的應用。

（三）微生物細胞的破碎

1肽聚糖在細菌細胞壁中起何種作用，革蘭氏陽性菌與陰性菌細胞壁肽聚糖含

量有何差別，

答:肽聚糖是真細菌細胞壁的特有成分。肽聚糖分子由肽和聚糖兩部分組成，

其中的肽包括四肽尾和肽橋兩種，而聚糖則是由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸兩

種單糖相互間隔連接成的長鏈。這種肽聚糖網格狀分子交織成一個致密的網套覆蓋

在整個細胞上，使細胞具有一定的形狀和強度。

雖然幾乎所有的細菌都含有肽聚糖網狀結構，但是革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）

的細胞壁結構與革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）有很大不同。革蘭氏陰性菌比陽

性菌復雜，在電子顯微鏡超薄切片觀察，可見革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，具有

20~80nm的肽聚糖層，約占細胞壁成分的40%~90%,此外細胞壁還含有大量磷壁

酸。而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，僅2~3nm,占細胞壁成分的10%左右，由于

肽聚糖之間僅由四肽側鏈直接連接，缺乏五肽橋，故層較疏松，而且肽聚糖位于細

胞壁最內層，緊貼在細胞膜上;在肽聚糖層外面還有一較厚的外壁層（約8~10

nm）,主要成分為脂蛋白、脂多糖和其他脂類，因此革蘭氏陰性菌細胞壁中脂類含

量較高。

2溶菌酶溶解細胞壁的機理是什么，

答案:溶菌酶溶解細胞壁是酶解法溶解細胞壁的一種。酶解法是利用酶反應，

分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達到破碎目的。

酶解法的特點是專一性強，因此在選擇酶系統時，必須根據細胞的結構和化學

組成來選擇。溶菌酶能專一地分解細胞壁上肽聚糖分子的B-1,4糖昔鍵，因此主

要用于細菌類細胞壁的裂解。例如在巨大芽抱桿菌、枯草桿菌、微球菌等革蘭氏陽

性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產生溶壁現象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用

溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。這主要是因為革蘭氏陰性菌結構中

肽聚糖的含量少，并處于細胞壁內層，外表面含有大量脂類（脂蛋白、脂多糖），而

脂多糖層需鈣鎂離子才能維持穩定性，故需利用EDTA除去鈣鎂離子，使脂多糖分

子脫落，外層膜出現洞穴，溶菌的才能發揮作用。放線菌的細胞壁結構類似于革蘭

氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，對于某些種類放線菌，有

時為了增強被酶作用的敏感性，在菌絲體培養過程中，添加適量抑制劑，如甘氨酸

和蔗糖等，使細胞壁容易溶解。酵母和真菌由于細胞壁的組分和結構與細菌明顯不

同，主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質等，因此不能用溶菌醮裂解，常用蝸牛酶、纖

維素酶、多糖酶等，有時采用幾種酶的混合物會產生更好的效果。植物細胞壁的主

要成分是纖維素，常采用纖維素醐和半纖維素醐裂解。

（03級生物技術1班鄧新林03120219）

3如何測定細胞破碎程度，

答案：

為了檢測細胞破碎的程度，獲得定量的結果，需要進行分析。常用的方法是測

定目的產物的釋放量，也可檢測細胞的破碎情況。

（一）、直接測定

檢測破碎前后完整細胞數量之差。利用顯微鏡或電子計數器可直接計數完整細

胞的量，所以可用于破碎前的細胞計量。破碎過程中所釋放的物質如DNA和其他聚

合物組分會干擾計數，故可用染色法把破碎的細胞從為損害的完整細胞中區別開

來，以便于計數破碎后的完

整細胞。例如:破碎的革蘭氏陽性菌常可染成革蘭氏陰性菌的顏色，利用革蘭

氏染色法未受損害的酵母細胞呈現紫色，而受損害的酵母細胞呈現亮紅色。

（二）、測定釋放的蛋白質量或酶的活力

測定細胞破碎后懸浮液中細胞內含物的增量。通常將破碎后的細胞懸浮液離

心，測定上清液中蛋白質的含量或酶的活力，并與100%破碎所獲得的標準數值比

較。（三）、測定導電率

利用破碎前后導電率的變化來測定破碎程度是一種快速方法。導電率的變化是

由于細胞內含物被釋放到水相中而引起的。導電率隨著破碎率的增加而呈線性增

加。因為導電率的讀數取決于微生物的種類、處理條件、細胞濃度、溫度和懸浮液

中電解質的含量，應預先采用其他方法來進行標化。

（四）沉淀法

1理解概念:硫酸錢飽和度，鹽溶，鹽析

硫酸鉉飽和度鹽溶鹽析

硫酸鐵飽和度:不飽和溶液的濃度和飽和用液濃度的比.

鹽溶：向蛋白質溶液中逐漸加入電解質，由于蛋白質的活度系數降低，剛起

始時蛋白質的溶解度增大，這種現象稱為鹽溶.

鹽析：繼續加入電解質，由于電解質的離子在水中發生水化，蛋白質的溶解

度減小，這種現象稱為鹽析

2沉淀與結晶有何不同，

沉淀法:濃縮作用，主要用于初步分離，主要適用于蛋白質等大分子，需要加

入沉淀劑，促進凝聚和沉淀。

結晶法:用于制備純物質，是精制的手段;主要用于抗生素氨基酸有機酸等小分

子，與沉淀法相比，其選擇性好，析出的晶體純度高。形成需要的晶體，且以過飽

和為動力，緩和的條件利于晶體的形成。

3有機溶劑沉淀蛋白質的機理什么，用乙醇沉淀蛋白質時應注意哪些事項，答：

有機溶劑沉淀蛋白質的機理是：

加入有機溶劑有利與蛋白質溶液中產生多種效應，這些效應結合起來使蛋白質

沉淀，其中主要效應是水的活度降低，當有機溶劑濃度增大時，水對蛋白質分子表

面上帶電基團或親水基團的水化程度降低，或者說溶劑介電常數降低，因而靜電吸

力增大，在憎水區域附近有序排列的水分子可以為有機溶劑所取代，是有些區域的

溶解性增大，但除了憎水性特別強的蛋白質如膜蛋白外，對多數蛋白質來說，后者

影響較小，所以總的效果是導致蛋白質分子的聚集而沉淀。

用乙醇沉淀蛋白質時應注意：

?降低溫度能增加收率和減少蛋白質變性，如用乙醇沉淀血漿蛋白，在TO?下

進行。？所選溶劑須和水互溶，和蛋白質不起作用，因而常用乙醇丙酮。

?蛋白質分子量越大，產生沉淀所需加入有機溶劑量越少。

?將1L濃度為C1(體積分數)的溶液加入熔劑，使其濃度達到C2所需加入溶劑

的ML數為1000(Cl-C2)/100-C2o

?一種蛋白質的溶解度通常會由于另一種蛋白質的存在而降低。

?沉淀的蛋白質如不能在溶解，就可能已變性。

?接近等電點時，以引起沉淀所需加入有機溶劑量較少。

?當溶劑梁達50%時，通常只有分子量小于1500的蛋白質仍留在溶液中。

?少量中性鹽的存在（0.1,0.2moi/L以上）能產生鹽溶作用，增加蛋白質在有機

溶劑水溶液中的溶解度，這就使沉淀蛋白質所需的有機溶劑量增大。