丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（熒光法）原理丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂質(zhì)過氧化物分解后形成的一種化合物，用于檢測脂質(zhì)氧化水平，該指標(biāo)在氧化應(yīng)激、鐵死亡等領(lǐng)域的研究中被廣泛使用。CheKine?Pro丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（熒光法）可檢測動植物組織，細(xì)胞、血清（漿）等生物樣本。在該試劑盒中，MDA在酸性和高溫環(huán)境下，可與硫代巴比妥酸（Thiobarbituricacid，TBA）縮合，生成TBA復(fù)合體，通過測定其熒光強(qiáng)度來檢測樣本中的MDA。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲存條件48T96TExtractionBufferⅠ60mL120mL4℃ExtractionBufferII24mL48mL4℃ReagentⅠ300μL600μL4℃，避光保存ReagentII52mL104mL4℃ReagentIII36mL72mL4℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentV20mL40mL4℃Standard(4.05mmol/mL)400μL400μL4℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。自備耗材·熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長520nm，發(fā)射波長550nm)·96孔全黑板、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ExtractionBufferII：即用型；4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。WorkingReagentIV：臨用前配制，將ReagentII全部轉(zhuǎn)移至ReagentIV中，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存6個月，避免反復(fù)凍融。ReagentV：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。WorkingReagentⅠ：每孔準(zhǔn)備600μL工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照ReagentIII：WorkingReagentIV=200μL：400μL的比例，混合均勻。WorkingReagentII：每孔準(zhǔn)備600μL工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照ReagentIII：ReagentV=200μL：400μL的比例，混合均勻。Standard(4.05mmol/mL)：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：ReagentI、ReagentIII、ReagentIV和Standard有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)品制備：100nmol/mLStandard：20μL4.05mmol/mLStandard用61μL去離子水稀釋得1mmol/mLStandard；10μL1mmol/mLStandard用990μL去離子水稀釋得10μmol/mLStandard；10μL10μmol/mLStandard用990μL去離子水稀釋得100nmol/mLStandard；使用100nmol/mLStandard，按照下表所示，進(jìn)一步稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品：序號100nmol/mLStandard體積（μL）去離子水體積（μL）濃度（nmol/mL）Std.11099010Std.289928Std.369946Std.449964Std.529982Std.619991Std.70.5999.50.5Blank01,0000注意：每次實(shí)驗(yàn)，請使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品；配制好的標(biāo)準(zhǔn)品需要在4h之內(nèi)使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBufferⅠ，用勻漿器或研缽冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細(xì)胞：收集500萬細(xì)胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入0.4mLExtractionBufferII，混勻后放置在冰上裂解5min，每2min混勻一次，直接置于冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟熒光酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)激發(fā)波長到520nm，發(fā)射波長到550nm。操作表（下述操作在1.5mL離心管中操作）：試劑空白管（μL）標(biāo)準(zhǔn)管（μL）測定管（μL）對照管（μL）樣本00200200Standard020000去離子水200000ReagentI2222WorkingReagentⅠ6006006000WorkingReagentII000600混勻后，95℃水浴反應(yīng)50min，取出后流水冷卻，10,000g離心10min，取200μL上清至96孔全黑板，記錄各孔的熒光值RFU，熒光激發(fā)波長520nm，熒光發(fā)射波長550nm，空白孔記為RFU空白，標(biāo)準(zhǔn)孔記為RFU標(biāo)準(zhǔn)，測定孔記為RFU測定，對照孔記為RFU對照。計(jì)算ΔRFU測定=RFU測定-RFU對照，ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)=RFU標(biāo)準(zhǔn)-RFU空白。注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次。如果樣本不存在溶血、脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本稀釋成不同濃度做預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合本試劑盒的線性范圍：0.04-10μM，選擇合適的稀釋倍數(shù)對樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程，將ΔRFU測定帶入方程得到x(nmol/mL)。MDA含量的計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算MDA(nmol/mgprot)=x÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：MDA(nmol/g鮮重)=x÷(W÷V1)=x÷W按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算MDA(nmol/104cell)=x÷(n÷V2)=0.4x÷n按樣本體積計(jì)算：MDA(nmol/mL)=xV1：加入ExtractionBufferⅠ體積，1mL；V2：加入ExtractionBufferII體積，0.4mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；n：細(xì)胞數(shù)量，以萬計(jì)。注意事項(xiàng)如果待測組織樣本勻漿中存在絮狀物，可多次離心取上清，避免測值不穩(wěn)定，復(fù)孔差異大。每次檢測都需要建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果RFU測定較低或ΔRFU測定為負(fù)值，可適當(dāng)增加樣本量或延長反應(yīng)時間，但不得超過100min。如果樣本測不出值，建議取新鮮樣本，重新檢測。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對樣品進(jìn)行檢測。Figure1.(a)MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線。(b)本試劑盒測定兔腎臟和玉米葉中MDA的含量。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB9300