DB37DB37/T2037—2012牛白細胞黏附缺陷癥（BLAD）基因分子檢測技術規(guī)程TechnicalSpecificationofMolecularDetectionforBovineLeukocyteAdhesionDeficiency(BLAD)Gene2012-02-09發(fā)布2012-03-01實施山東省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I1SN/T1917-2007牛地方流行性白牛BLAD發(fā)病原因是由于CD18亞單位編碼區(qū)的383位堿基由A突變?yōu)镚引起的。基于該2用酚-氯仿抽提法從抗凝血或者血凝塊中提取基因組DNA。抗凝血和血凝塊的預處理按照SN/T1917-2007的規(guī)定執(zhí)行。DNA的提取按照NY/T1672-2008中的規(guī)定執(zhí)行。也可用商業(yè)化DNA提取試劑盒從細管中取出精液放入1.5mL離心管中，然后，加入500μL生理鹽水，混勻，除去卵黃稀釋液及精輕輕混勻，12000rpm離心10min；吸取上清液，轉至1.5mL離心管中，加入150μL酚和150μL氯仿，輕輕混勻5min；吸取上清液，加入500μL無水乙醇（4℃保存），輕輕顛倒混合；用滅菌槍頭將白色沉淀挑25μL反應體系：10×Buffer2.5μL、50mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTP0.6μL、TaqDNA聚合酶2U、10μmol/L引物各1.0μL、模板DNA594℃預變性5min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保37.5.3將混合液緩慢倒入制膠板中，排除氣泡，插入多齒梳子。待凝膠凝固后，拔出梳子，將凝膠轉移至水平電泳槽中，往電泳槽中加入1×TAE緩沖液，使電泳緩沖液沒過膠面。7.5.4將待檢PCR產物5μL和上樣緩沖液(6×DNALoadingBuffer)以5:1的比例混合均勻，加入點樣孔；同時選擇點樣孔點上5μL2000bpDNAMarker作參照。恒壓100V,電泳30min。電泳結束后7.6測序分析8結果判定8.1PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測牛CD18基因PCR擴增產物僅出現(xiàn)874bp的條帶(圖1),則表示擴增特異性好，可進行下一步的測序分析。圖1牛CD18基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜8.2結果判定與表述表述為正常牛；第501位堿基為A或G時，且測序峰圖為套峰，表明是基因型AG,屬于雜合子，該個體表患病牛。圖2牛CD18基因PCR產物測序結果45主要試劑配制A.210%SDS(十二烷基硫酸鈉)：100A.40.5mol/LNaCl（A.9TE緩沖液取1mol/LTris.HCl（pH8.0）10mL，0.5m1mol/LTris-HCl(pH=8.0)1mL，0.56在10mL水中加入100mg的溴化乙錠（EB），溶解后分裝成7主要儀器設備2μL，10μL，20μL，100μL，8使用溫度范圍45-135℃,最高使用壓力0.255Mpa。溫控范圍50-300℃,箱內尺寸350*350*450mm。91TTACAAGTGCAGGTGGTGATTAAGATGACGAGGAAGTGGGGGGGGGTGTCCCAGGATGGCCACTTAGCAGCTGGTGGTAGAGAAGGCCTTACAACAGTGTGATAACATGACACTCTATATCTCTGTATCTATGTCAGAACGTGTGCTTGCCTGAAATGCACCAGCATAAGAGAATGGGGAGAGTCCTGTGCCCATGAACCCCCCCCACCCCCAGACCAGTGGCAGGTCAGGCAGTTGCGTTCAACGTGACAGCTGGGGGGTGACCTGCTCCGGGCCCTCAATGGCAGGCAGCTACTCCATCTTCCCCTGAAACCCCAAGCCTGCACCCCAAGGGCAGGGCGCCAGGCCCC