/1The

BD

Horizon?

TourBD多色流式全面解決方案

BD生物科學(xué)

JudyBD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/2Identification

of

immune

cell

subsets

by

eight-color

antibody

stainingNat

Rev

Immunol,2012BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/3Nat

Rev

Immunol,

2012Eight-color

antibody

panels

proposed

by

the

Human

Immunophenotyping

ConsortiumBD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/4

多色方案中熒光素選擇的重要性

熒光素同抗原的搭配

優(yōu)化儀器配置，提高分辨率

多色Panel設(shè)計(jì)實(shí)例分析主要內(nèi)容

/5The

BD

Horizon?

Tour流式多色方案中熒光素選擇的重要性CD3V450BV510BV421BV605

CD4

?

合適的熒光素選擇幫助我們更好的理解實(shí)驗(yàn)

?

對于弱的抗原，亮的染料尤為重要BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/6熒光素的選擇是關(guān)鍵CD3PerCP-Cy5.5PE

BV421PE-CF594

V450Alexa

Fluor647

FITCAlexa

Fluor700熒光素的選擇是關(guān)鍵

CD197

(CCR7)

選擇正確的熒光素組合是回答生物學(xué)問題的關(guān)鍵BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/7熒光素分辨率等級??

等級由細(xì)胞經(jīng)不同克隆，不同規(guī)格的抗體在多種流式細(xì)胞儀上的實(shí)驗(yàn)所得的染色指數(shù)（分辨

率）的比較決定

激光器的能量，PMT電壓，光學(xué)部件，抗體克隆和生物樣品等多種因素均會影響熒光素/試

劑在某個(gè)特定儀器上的效果BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/8BDAccuri?C6BDFACSVerse?BDFACSCanto?IIBDFACSVerse?BDFACSCanto?IIBDLSR?FortessaBDLSRFortessaX-20BDLSR?FortessaBDLSRFortessaX-20488nmFITCPEPerCP-Cy5.5FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7FITC（BB515）PEPE-CF594PerCP-Cy5.5PE-Cy7FITC（BB515）PerCP-Cy5.5640nmAPCAPCAPC-Cy7APCAPC-Cy7APCAlexaFluor700APC-H7/APC-Cy7APCAlexaFluor700APC-H7/APC-Cy7405nmBV421/V450BV510/V500BV421/V450BV510/V500BV605BV650BV711BV786BV421/V450BV510/V500BV605BV650BV711BV786561nmPEPE-CF594PE-Cy5PE-Cy7355nmBUV395BUV737BUV395BUV737#Lasers22345BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/9基于儀器配置選擇熒光素BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/10BD

Horizon

Brilliant?

Violet?

六種被紫激光激發(fā)的染料–

基礎(chǔ)多聚體:

BV421

and

BV510–

串聯(lián)體:

BV605,

BV650,

BV711

and

BV786?

亮的染料?

減少交叉激光激發(fā)?

減少樣品制備影響與其他染料的比較BV421BV786BV711BV605BV650

BV510PE

BV

CD4

試劑與PE比較BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/11Buffer

Compatibility

–

Surface

StainPerm

III

Solution

Stain

-

Fix/Perm

Fix/Perm

-

Stain

Hu

CD4

BV786

Transcription

Factor

Buffer

Stain

–

Fix/Perm

Fix/Perm

-

Stain

Hu

CD4

BV510BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/12IFN-g

PEIFN-g

PEBuffer

compatibility

:

intracellular

stainingUnstimulatedCMV

pp65

CD4

CD8BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/13SEBBD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/14紫激光配置檢測光學(xué)部件需匹配所用的熒光素?

許多儀器已經(jīng)配置可以使用納米晶體染料?

為最大限度地發(fā)揮BD

Horizon

Brilliant

Violet

的

組合優(yōu)勢，儀器可能需要

更新配置?

更新配置可提高擴(kuò)展儀器的性能BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/15BD

Horizon

Brilliant

Ultraviolet

(BUV)兩種被355nm紫外激光激發(fā)的新熒光素??BUV395:

對其他檢測其幾乎無溢漏BUV737:

對Alexa

Fluor

700中等溢漏

BUV395

中等亮度Exmax/Emmax:

348

nm/395

nm濾光片:

379/28BP

BUV737

明亮Exmax/Emmax:

348

nm/737

nm濾光片:

740/35BP;

690LP與其他染料的比較BUV395

BV421

PE

FITC

BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/16BUV737BUV

CD4

試劑與

PE,

BV421和

FITC

比較BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/17BD

Horizon

Brilliant

Blue

(BB515)?

Brightness:

Very

Bright?

Ex

Max

490

nm?

Em

Max

515nm?

Filter:

Same

as

FITC

(e.g.

530/30

nm)BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/18BB515

is

up

to

seven

times

brighter

than

FITCHu

CD4Hu

CD3Ms

CD11bHu

CD19Hu

CD127BB515FITCA488PEFITCA488Hu

CD3302438174166

40151Hu

CD4Hu

CD19Ms

CD8aMs

CD11b174

85

86

68471624155815502645453623Hu

CD1273794x

BrighterStain

IndexBetter

resolution

of

dim

markersCD25

FITC

or

CD25

BB515

and

CD3

PerCP-Cy5.5,

CD4

APC,

CD127

PE

BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/19CD25

FITCCD25

BB515

/20熒光素同抗原的搭配??理解抗原表達(dá)的特性選擇最合適熒光素偶聯(lián)的抗體

The

BD

Horizon?

Tour抗原的分類

CD4CD45RA

CD25

三大類:

?

Primary:

很好鑒定，容易區(qū)分陰陽性細(xì)胞群，

陰陽性峰分得很開

–

Examples:

CD3,

CD4,

CD45

?

Secondary:

很好鑒定，較高水平表達(dá)，經(jīng)

常連續(xù)性表達(dá)

–

Examples:

CD27,

CD28,

CD45RA,

CD45RO

?

Tertiary:

低水平表達(dá)，激活性marker，或者

表達(dá)區(qū)分不明顯

–

Example:

CD25Mahnke

YD,

Roederer

M.

Optimizinga

multicolorimmunophenotypingassay.

Clin

Lab

Med.

2007;

27:469-485.

BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/21BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/22???抗原密度一定是在細(xì)胞亞群水平上確定的這個(gè)規(guī)則會由于通道間相互溢漏，共表達(dá)等原因有所改變抗原密度也會由于激活狀態(tài)而有所改變

抗原密度列表在表達(dá)最低密度的抗原上匹配最亮的熒光素抗原和熒光素的組合high

lowBD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/23mediumBD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/24抗原共表達(dá)Marker的共表達(dá)：?

Population

resolution

is

impacted

by

spillover.

細(xì)胞群的分辨率會受到通道溢漏的影響?

Markers

co-expressed

on

specific

cell

types

should

beconjugated

to

spectrally

separated

fluorochromes.?

在特定細(xì)胞亞群共表達(dá)的marker應(yīng)該偶聯(lián)光譜分離的熒光素T

細(xì)胞panel中-可能用到的marker:

CD3,

CD4,

CD8,CD45RA,

CD27,

CCR7,

CD25,

CD127

/25The

BD

Horizon?

Tour優(yōu)化儀器配置，提高分辨率分辨率的重要性優(yōu)化儀器設(shè)置：CS&T熒光溢漏BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/26分辨率分辨率

–流式細(xì)胞儀區(qū)分弱染色信號和未染色信號的程度在多色情景下更為復(fù)雜清晰分群的能力取決于背景和陰性群體的分散度。分辨率

vs.

背景“Negative”DimBright

陰性群體背景低，分群清晰。

陰性群體背景高，不能清晰分

群。

陰性群體背景低但分散度（相

對標(biāo)準(zhǔn)偏差）大，不能清晰分

群。BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/27染色指數(shù):

分辨率的度量標(biāo)準(zhǔn)染色指數(shù)

亮度/MFI陰性信號的寬度/SD

亮度陰性信號的寬度–

儀器性能

–

檢測效率,

背景熒光和電子噪

音

[單色]

–

溢漏

[多色方案]BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/28??亮度取決于

?

試劑

抗原密度，所用熒光素

?

儀器

?

通道電壓增益，激光器能量

?陰性群體的寬度取決于BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/29流式細(xì)胞儀設(shè)置和跟蹤(CS&T)系統(tǒng)?

CS&T是一個(gè)由軟件（FACSDiva

和

FACSuite）和試劑（CST微球）整合而成的完整系統(tǒng)。?

CS&T

系統(tǒng)的作用–確定決定儀器性能，影響靈敏度/群體分辨率的因素?

相對熒光檢測效率

(Qr)?

相對光學(xué)背景

(Br)?

系統(tǒng)電子背景噪音

(SDen)–標(biāo)準(zhǔn)化儀器設(shè)置?

應(yīng)用設(shè)置–跟蹤儀器性能BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/30CS&T

系統(tǒng)的益處?

科學(xué)家/使用者–從多色實(shí)驗(yàn)中得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)?

每天提供穩(wěn)定并可重復(fù)的數(shù)據(jù)–根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化儀器設(shè)置?

提供每次實(shí)驗(yàn)時(shí)儀器狀態(tài)的參數(shù)?

平臺負(fù)責(zé)人/操作者–盡早發(fā)現(xiàn)儀器性能的下降?

幫助確定問題的來源–提供設(shè)置儀器的信息（系統(tǒng)電子背景噪音）

/31The

BD

Horizon?

Tour熒光溢漏BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/32熒光溢漏的重要性1.

多色方案群體分辨率為了使感興趣的群體獲得最好的分辨率，熒光溢漏是方案設(shè)計(jì)時(shí)唯一最為重要的因素。2.

復(fù)雜數(shù)據(jù)的可視性不正確或欠佳的溢漏值計(jì)算會對實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面的影響。NegativePositiveMFIrSDMFIrSDNoComp12293098291Comp4293289PE-Cy7的陽性群體和陰性群體的平均熒光強(qiáng)度是相等的。

然而，溢漏所致的信號分散（rSD）及因此引起的分辨

率降低并不能被補(bǔ)償所消除。

PerCP-Cy5.5BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/33rSD

熒光溢漏到其他檢測器導(dǎo)致背景及信號分散，

影響分辨率

熒光溢漏到其他檢測器：比如

PerCP-Cy5.5溢漏到PE-Cy7的檢測

器

熒光溢漏導(dǎo)致：

?

背景信號(MFI)增強(qiáng)

?

信號分散/分散度（rSD）將溢漏所致的背景扣除的過程稱為補(bǔ)償。

rSD

當(dāng)樣品經(jīng)過正確地補(bǔ)償后，被溢漏的檢測器所檢測到

/34The

BD

Horizon?

Tour單色對照計(jì)算溢漏值的工具BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/35補(bǔ)償對照

–

微球?

補(bǔ)償微球的優(yōu)勢–易用–不需要細(xì)胞–對于多數(shù)熒光素，所得的補(bǔ)償值與細(xì)胞所得的一致

/36The

BD

Horizon?

Tour

多色Panel設(shè)計(jì)實(shí)例分析For

Research

Use

Only.

Not

for

use

in

diagnostic

or

therapeutic

procedures.APC-Cy7:

US

Patent

5,714,386Alexa

Fluor?

is

a

registered

trademark

of

Life

Technologies

Corporation.CF

is

a

trademark

of

Biotium,

Inc.Cy?

is

a

trademark

of

GE

Healthcare.

Cy?

dyes

are

subject

to

proprietary

rights

of

GE

Healthcare

and

Carnegie

Mellon

University

and

are

made

and

sold

underlicense

from

GE

Healthcare

only

for

research

and

in

vitro

diagnostic

use.

Any

other

use

requires

a

commercial

sublicense

from

GE

Healthcare,

800

CentennialAvenue,

Piscataway,

NJ

08855-1327,

USA.BD,

BD

Logo

and

all

other

trademarks

are

property

of

Becton,

Dickinson

and

Company.

?

2014

BD23-16447-00BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/37?

依據(jù)–

機(jī)器性能

(光路配置)–

分析中的生物學(xué)內(nèi)在關(guān)系(目的細(xì)胞群，抗原密度和共表達(dá))–

選擇的熒光素優(yōu)先順序

(熒光亮度和通道間溢漏)?

應(yīng)用邏輯規(guī)則分配熒光素給特異性抗體多色實(shí)驗(yàn)Panel設(shè)計(jì)實(shí)例分析BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/386色Treg細(xì)胞配色實(shí)例Blue(488nm)FITC/AlexaFluor488/BB515PEPerCP-Cy5.5/PerCPPE-Cy7Red(640nm)APC/AlexaFluor647APC-H7/APC-Cy7根據(jù)抗原表達(dá)分配熒光素的原則來優(yōu)化panel舉例2-最好的實(shí)踐進(jìn)一步優(yōu)化panel使Treg的分辨率最大化

?

抗原密度&共表達(dá)

?

熒光素的亮度

?

由于通道間溢漏導(dǎo)致的分散程度

BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/39

6色Treg細(xì)胞配色實(shí)例舉例1-遵循規(guī)則雙激光6色BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/40抗原密度和熒光素亮度匹配Fluorochrome

PE

APC

PE-Cy7

FITC

PerCP-Cy5.5

APC-Cy7Specificity

CD25

CD127

CD45RA

CD4

CD8

CD3ANTIGENASSIGNMENTLaser????熒光染料的強(qiáng)度與抗原表達(dá)水平相匹配低密度表達(dá)抗原需要更亮的熒光素?zé)晒馊玖现g的重疊最小避免偶聯(lián)染料帶來的假陽性

CD3

FITC

CD4

PerCP-Cy5.5

CD8

APC-H7

CD45RAAPC

CD127

PE-Cy7

CD25

PEBD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/41

CD3

FITC

CD4

APC-H7CD8

PerCP-Cy5.5

CD45RA

PE-Cy7

CD127

Alexa

Fluor

647

CD25

PE

優(yōu)化Panel設(shè)計(jì)來提高Treg的分辨率?

通過

分配PerCP-Cy5.5給CD8來減少PerCP-Cy5.5溢漏到PE-Cy7

通道的影響?

通過分散CD25和CD127到不同激光管和選擇最小溢漏熒光素來提高

Treg分辨率SSCCD127

Alexa

Fluor

647CD8

PerCP-Cy5.5CD45RA

PE-Cy7BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/426色T細(xì)胞Panel:

舉例2優(yōu)化panel后使熒光通道溢漏最小化FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7Alexa

Fluor

647APC-Cy7CD3CD25CD8CD45RACD127CD4CD25

PE

CD3

FITCCD4

APC-Cy7CD25

PECD127

PE-Cy7CD45RA

APCCD127

Alexa

Fluor

647CD45RA

PE-Cy7BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/432nd

6色Panel中例1，例2結(jié)果比較1st

Example

?

例2中CD127和CD25

的分辨率都得到提高

?

例2中比較容易對Treg圈門

CD25

PEExample

CD25

PECD25

PE

CD25

PE

/44The

BD

Horizon?

Tour8色T細(xì)胞Panel設(shè)計(jì)Blue(488nm)FITC/AlexaFluor488/BB515PEPerCP-Cy5.5/PerCPPE-Cy7Red(640nm)APC/AlexaFluor647APC-H7/APC-Cy7Violet(405nm)BV421/V450BV510/V5008色T細(xì)胞Panel設(shè)計(jì)2個(gè)不同方案Expanding

the

6-color

panel

to

an

8-color

panel

Scenario

#1從已有的6色panel開始，在拓展的機(jī)器配置上添加marker優(yōu)化6色方案

Scenario

#2按照多色panel設(shè)計(jì)的原則，根據(jù)機(jī)器配置建立特異性的8色方案

BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/45CD3CD4CD8CD25CD127FITCAPC-Cy7PerCP-Cy5.5PEAPCCD45RA

PE-Cy7CCR7

BV421CD27

BV510

方案1:

6色Panel優(yōu)化到8色Panel紫激光可得?

BV421

and

BV510:

2個(gè)最亮的熒光素?

亮度和少的溢漏允許被添加進(jìn)panel?

然而6色panel并沒有考慮添加更多marker，

因此對于8色panel來說，并不是最佳的

–

添加了2個(gè)新的marker，但整個(gè)panel并

沒有遵循panel設(shè)計(jì)的原則BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/46CD127

Alexa

Fluor

647CD8

PerCP-Cy5.5SSCCD45RA

PE-Cy7CD45RA

PE-Cy7BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/47方案1CD3

FITCCD27

BV510CD4

APC-Cy7CD25

PECD27

BV510CCR7

BV421CCR7

BV421

V450

V500BD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/48

Fluorochrome

BV421

PE

PE-Cy7APC/Alexa

Fluor

647

FITC

PerCP-Cy5.5

BV510

APC-Cy7Specificity

CCR7

CD27

CD25

CD127

CD45RA

CD8

CD3

CD4Laser方案2:按照3激光配置優(yōu)化最佳8色方案

ASSIGNMENTCD127

Alexa

Fluor

647CD8

PerCP-Cy5.5SSCCD45RA

FITCCD45RA

FITCBD

Horizon?

之旅:

多色方案設(shè)計(jì)的新視野/49CD3

BV510CD27

PECCR7

BV421CD4

APC-Cy7CD25

PE-Cy7CD27

PECCR7

BV421方案2:按照3激光配置優(yōu)化最佳8色方案CD127

Alexa

647CD45RA

PE-Cy7CD45RA

PE-Cy7CD45RA

PE-Cy7CD127

Alexa

647CD45RA

FITCCD45RA

FITCCD45RA

FITC

8-Color

Panels:

例1和例2中的補(bǔ)償

1st:

UsingExisting

6-Color

PanelCD25

PECD25

PE-Cy7CCR7

BV421CCR7

BV421

2nd:Building

From

ScratchCD27

PECCR7

BV421CD27

BV510CCR7

BV421

CD25

PE

gives