全面的WB實驗疑難解析及磷酸化蛋白檢測技巧滕敏高級質控工程師北京義翹神州科技股份有限公司免疫實驗技術全攻略CONTENTWesternBlot技術介紹1WesternBlot常見問題解析2磷酸化蛋白檢測技巧3WesternBlot保證型抗體開發4義翹神州WesternBlot技術介紹01義翹神州WB（免疫印跡）技術概覽樣本（蛋白質）電泳分離利用聚丙烯酰胺凝膠按照蛋白質的分子量大小進行分離樣本轉移到固相支持物例如：NC膜或PVDF膜檢測目的蛋白孵育一抗和二抗目的蛋白可視化化學發光等檢測方法優勢高特異性、高靈敏度能夠在復雜的蛋白質混合物中精準地檢測到特定的目標蛋白應用場景生物醫學研究、疾病診斷、藥物研發等在癌癥研究中，可以檢測腫瘤相關蛋白的表達水平變化在免疫學研究中，能夠分析免疫細胞中特定免疫分子的表達情況WesternBlot技術介紹4樣品制備電泳轉膜（濕法）抗體孵育目的蛋白可視化檢測化學發光儀熒光成像系統WB顯色展示5WesternBlot技術介紹WB實驗流程概述細胞樣品制備組織樣品制備細胞收集組織破碎加預冷的裂解液加預冷的裂解液，研磨儀研磨樣品類型樣本收集樣本洗滌樣本預處理樣本制備6預冷PBS洗滌低溫裂解，超聲WesternBlot技術介紹WB實驗技術要點---樣本制備RIPA裂解液：成分較為復雜，包含離子型、非離子型去污劑和去垢劑，能有效裂解細胞并溶解蛋白，用于WB等實驗

NP

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40裂解液：非離子型去污劑，性質相對溫和，在裂解細胞的同時可以保持蛋白的天然狀態，用于IP實驗分離膠濃度目標蛋白分子量7.5%80-300kDa10%30-300kDa13%10-100kDa15%5-70kDaTris-甘氨酸電泳系統Bis-Tris電泳系統濃縮膠60-80V70-90V分離膠100-120V120-150VpH8.35.8-7.2電泳過程是不同分子量蛋白進行分離，這是個產熱過程，必要情況需增加冷卻裝置。7分離范圍分離相對分子質量范圍較寬的蛋白質適合分離等電點接近，分子量差異小的蛋白質WesternBlot技術介紹WB實驗技術要點---電泳目標蛋白分子量濕法轉膜時間80-300kDa110V,150min30-180kDa110V,90min10-60kDa110V,60min蛋白分子量與轉膜時間濕法轉膜和半干轉膜的區別

濕法轉膜半干轉膜儀器濕法轉膜儀半干轉膜儀時長長(90-150min)短(30-90min)轉膜液用量多少轉膜效率高低于濕法膜背景低高適合分子量所有<100kDa8濾紙濾紙膠膜-+轉膜示意圖WesternBlot技術介紹WB實驗技術要點---轉膜目標蛋白信息：分子量、氨基酸序列、結構特點、翻譯后修飾樣本類型：明確樣本來源：人、動物、植物、細胞系廣泛引用的抗體通常具有較高的可靠性和適用性試用裝：您可向義翹神州申請試用裝，用以測試抗體在實際實驗中的性能。

可以避免購買到不適合實驗的抗體減少不必要的損失特異性：高特異性的抗體能夠準確地識別目標蛋白，而不與其他蛋白發生交叉反應親和力：高效價的抗體具備更高的靈敏度，可檢測更低濃度的蛋白該抗體已被驗證具備WB應用義翹神州磷酸化抗體：均經WB應用驗證，具備高特異性明確檢測目標高引用的抗體抗體性能評估

應用驗證品牌較強抗體開發實力的品牌具備更高品質的WB應用抗體。義翹神州WB應用抗體：覆蓋熱門靶點包涵磷酸化抗體、標簽抗體、內參抗體、二抗

涵蓋各種屬9WesternBlot技術介紹WB實驗技術要點---一抗、二抗的選擇樣本類型內參蛋白分子量表達特性適用條件不適用條件胞漿和全細胞β-Actin43kDa結構蛋白，不同組織的細胞結果會有差異誘導后樣本或檢測磷酸化等修飾后樣本血紅細胞、無細胞結構樣本，如血漿、組織液α-Actin43kDaβ-tubulin50kDaα-tubulin55

kDaGAPDH36kDa代謝類蛋白，在活組織中表達恒定，誘導處理影響表達量多組織多樣本比對表達量時可選GAPDH核蛋白PCAN29kDa細胞周期內表達穩定細胞核內蛋白檢測胞質血清transferrin77kDa轉鐵蛋白在血清中相對穩定血清疾病血清內參蛋白要與目標蛋白分子量相差10kDa以上常用內參抗體推薦：beta-Actin(Cat#:100166-MM10)、beta-Tubulin(Cat#:100109-MM05T)、GAPDH(Cat#:100242-MM05)10WesternBlot技術介紹WB實驗技術要點---內參的選擇彩色長紅外染料標記不需底物條帶直觀可見信號持久可保存半年以上黑白短大多1s完成HRP標記需底物靈敏度高不持久不宜長期保存化學發光成像系統熒光成像系統Odyssey圖片適用二抗掃描時間顯色信號11WesternBlot技術介紹WB實驗技術要點---顯色√目的條帶單一，無雜帶，信號強√

KO驗證抗體Cat#:

101887-R003×有其他雜帶，信號極弱1302501001803007055AA100705535402515130180×沒有信號12WesternBlot技術介紹WB顯色結果案例展示用于量化蛋白表達水平，可以作為一種定量數據

條帶顏色越深，灰度值越高，蛋白含量越高；反之，條帶顏色越淺，蛋白含量越低用于驗證實驗的可靠性和重復性。在重復實驗中，目標蛋白的灰度值變化趨勢一致，說明實驗結果較為可靠編號ABCDEF條帶1灰度值3628257442049021418166849318條帶2灰度值03050116167956586015213actin灰度值130742081815015211632521322528比較不同樣品中蛋白的表達水平分析蛋白表達的變化趨勢驗證實驗結果13WesternBlot技術介紹WB實驗技術要點---灰度值WesternBlot常見問題解析02義翹神州可能的原因解決方案檢測樣本不表達目的蛋白加高表達陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性檢測樣本低表達目的蛋白提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑抗體不能識別測試種屬的相關蛋白仔細確認是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白一抗孵育時間不足4℃結合過夜二抗與一抗不匹配選擇針對一抗來源的種屬的抗體洗膜過度洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，可使用0.1%的Tween-20轉膜不充分/過轉優化轉膜條件HRP或底物活性降低測試活性或選用敏感底物15WesternBlot常見問題解析WesternBlot結果---無信號或顯示信號弱可能的原因解決方案膜封閉不夠延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液(如5%BSA的TBST)一抗孵育的溫度偏高4℃結合過夜一抗、二抗特異性差，和膜有非特異結合選擇合適的一抗、二抗HRP過高（背景較高）降低二抗的使用濃度選擇的膜容易產生高背景一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低膜在實驗過程中干過實驗過程中要注意保持膜的濕潤TBST洗脫不足增加洗脫時間、次數、用量曝光時間過長調整合適的曝光時間16WesternBlot常見問題解析WesternBlot結果---背景高描述條帶呈笑臉狀︶條帶兩邊向下彎曲︵條帶上有不顯影的圓形部分示例圖片原因凝膠不均勻電泳系統溫度偏高凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全轉膜不良（如有氣泡在膠-膜之間)解決方案改善凝膠配置環境將電泳系統放置冷卻裝置，降低電壓，防止電泳系統溫度過高優化配膠過程鋪好膜和膠，用滾筒充分按壓滾動，去除氣泡17WesternBlot常見問題解析WesternBlot結果---帶型異常描述條帶有紋理（縱向條紋）條帶偏斜，向兩邊擴散條帶成點狀條帶有拖尾現象示例圖片原因樣品中含有不溶性顆粒電極不平衡上樣量過大樣品中鹽濃度過高樣品溶解不好解決方案樣品高速離心5min后吸取上清進行上樣調整電極降低樣品上樣量鹽離子移動速率高。電泳時，可先低壓20V跑30min，使鹽離子遠離蛋白條帶。增加loadingbuffer的用量18WesternBlot常見問題解析WesternBlot結果---帶型異常描述反白現象（條帶中心位置出現反白）邊緣效應（位于膜靠邊緣的條帶膠弱）黑點或黑斑（膜上多處出現邊緣發白的黑點）

示例圖片原因條帶過曝，目的蛋白含量太高或者一抗、二抗濃度偏高雜交袋封邊太靠近膜膜與顯色的儀器接觸面有氣泡解決方案降低蛋白上樣量或者調低一抗、二抗的濃度能有效改善雜交袋封邊的時候四邊都留一些余地，尤其是目的條帶出現的一側，讓抗體和膜能充分進行孵育將膜放在顯色液里浸泡1-2s，撈出后緩慢放在一起，將氣泡趕到另一側19WesternBlot常見問題解析WesternBlot結果---帶型異常Q：為什么各個抗體都要進行WB預實驗？A：對WB結果有決定性影響的因素是蛋白表達量、抗體的效價。正確使用抗體可以保證抗體與抗原更加有效的結合。每一個抗體都有其特性，因此我們須通過WB預實驗獲得背景小，非特異性條帶少的實驗結果。預實驗的內容如下：1）確定一抗的稀釋比例和孵育時間；2）選擇合適的封閉液及封閉時間；3）調節合適的上樣量，使內參條帶灰度值趨于一致。Q：抗體檢測時樣本上樣量怎么確定？A：1.細胞裂解液、組織裂解液、膜裂解液，根據BCA測定的總蛋白含量，上樣量20-40μg。2.重組蛋白類樣品，根據抗體靈敏度和親和力，上樣量2-200ng。20WesternBlot常見問題解析WesternBlot結果---常見問題Q&AQ：抗體使用有哪些注意事項？A：使用抗體前需仔細閱讀說明書，了解抗體的保存條件以及不同用途下的推薦稀釋比例。不同品牌的抗體的濃度、體積不相同，較高濃度的抗體（>0.5mg/mL）通常性質更穩定。所以購買時應注意比較，經驗不足的實驗者往往被抗體的體積迷惑，要注意相同質量下低濃度的抗體體積反而更大。Q：抗體室溫孵育2h和4℃過夜孵育有什么區別？A：抗體孵育時間需要根據預實驗進行優化，一般情況下室溫孵育2h能明顯先出條帶的，可以沿用這個方式；有的抗體，如磷酸化抗體，目標蛋白豐度較低，或抗體效價低，可以4℃過夜孵育，增加目的條帶檢出的概率。21WesternBlot常見問題解析WesternBlot結果---常見問題Q&A磷酸化蛋白檢測技巧03義翹神州蛋白質磷酸化在蛋白質激酶催化下把ATP或GTPγ位磷酸基團轉移到底物蛋白質氨基酸殘基上的過程。蛋白質蛋白質磷酸化蛋白的重要性：調控細胞信號轉導調節酶活性影響蛋白質的定位和穩定性參與細胞周期調控對于理解疾病的發病機制和開發新的治療方法具有重要意義磷酸化抗體能夠檢測蛋白質磷酸化狀態，反映信號通路活性，為藥物開發提供方向。磷酸化蛋白檢測磷酸化抗體VS常規抗體磷酸化抗體常規抗體識別位點特異識別磷酸化位點識別蛋白各個位點檢測蛋白檢測受刺激時蛋白的變化情況及活性狀態檢測蛋白的表達情況免疫原多肽，磷酸化蛋白多肽，重組蛋白蛋白類型大部分是轉錄相關因子各種類型磷酸化抗體開發難點：24磷酸化抗體特點磷酸化是一種動態的修飾過程，在不同的生理條件和刺激下，蛋白質的磷酸化位點可能會發生變化磷酸化蛋白豐度低，需要有高靈敏度的抗體來檢測由于磷酸化抗體需要特異性地識別磷酸化位點，因此對抗體的特異性要求非常高磷酸化蛋白往往不穩定，容易發生去磷酸化等變化，需要在特定的條件下進行樣品處理和保存大體分為3類：兔多克隆抗體、鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體兔單抗因具備更多優勢，義翹神州開發的磷酸化抗體均為兔單抗25更多陽性抗體更好的多樣性識別更多表位開發人鼠蛋白抗體結構更穩定親和力更高特異性更好靈敏度更高磷酸化抗體特點磷酸化抗體類型01樣本制備02單B細胞介入03抗體篩選04抗體特異性驗證對樣本進行藥物刺激，使目標蛋白磷酸化高水平表達。樣本制備關系到能否篩選到合適的磷酸化抗體ELISA篩選后進行WB介入抗體純化進行磷酸化特異性篩選篩選磷酸化特異性好的WB抗體進行特異性驗證26磷酸化抗體開發磷酸化抗體檢測流程27樣本制備檢測高表達細胞系合理的刺激時間磷酸酶抑制劑低溫裂解樣本保存設置陰陽性對照添加內參、總蛋白抗體封閉液4℃過夜孵育一抗TBST洗液磷酸化蛋白檢測磷酸化蛋白檢測的注意事項首先可以查閱文獻。許多研究論文會提及某些細胞系在特定蛋白磷酸化過程中的高表達情況，比如在研究癌細胞增殖相關的磷酸化蛋白時，某些腫瘤細胞系如HeLa細胞（人宮頸癌細胞）、A549細胞（人肺癌細胞）常常被用于相關研究。可以通過humanproteinatlas等數據庫來選擇。通過細胞功能相關性來選擇細胞。若研究和神經信號傳導有關的磷酸化蛋白，就優先選擇神經元細胞，像SH-SY5Y細胞（人神經母細胞瘤細胞）這類與神經功能密切相關的細胞系。28樣本制備——高表達細胞系doi:10.1128/MCB.00365-16磷酸化蛋白檢測樣品中蛋白質磷酸化水平較低或不表達，因此需要通過物理或化學方法進行誘導或刺激。不同靶點刺激的時間和強度不同，需要查找文獻或進行預實驗。刺激需要做到充分但不過量。刺激過久可能會進入負反饋機制，造成檢測結果下降。29樣本制備——合理的刺激時間1801007050130250300Phospho-VEGFR2(Tyr1175)HUVECcells0025153060minVEGF饑餓-++++++磷酸化蛋白檢測kDa18010070130250300Helacells饑餓-++++++++002510203060120minkDaEGFPhospho-ErbB3/HER3(Tyr1289)磷酸酶抑制劑能防止樣本的去磷酸化，提高實驗的準確性。30MCF-7cells磷酸酶抑制劑推薦：貨號產品名稱純度C04-902PhosphataseInhibitors:NSC-663284>98%P16-902PhosphataseInhibitors:Okadaicacid,freeacid>98%(TLC)P16-902CPhosphataseInhibitors:Cantharidin>98%(HPLC)如果檢測的蛋白磷酸化位點是酪氨酸，還需添加1μM的原釩酸鈉。--++Phosphatase515515minneuregulin-1Phospho-ErbB3/HER3(Tyr1289)kDa磷酸化蛋白檢測樣本制備——磷酸酶抑制劑樣本低溫處理樣本常溫處理樣本在冰上或冰盒中處理持續保持樣品低溫31VSHEK293cellsUV3510070554025151301801h2hkDaPhospho-Chk1(Ser317)3510070554025151301801h2hUVkDaPhospho-Chk1(Ser317)HEK293cells磷酸化蛋白檢測樣本制備——低溫裂解樣本保存：建議-80℃保存處理好后分裝存儲，不要反復凍融新鮮樣本32351007055402515130180-+UV,1hkDaHEK293cells351007055402515130180-+UV,1hkDaPhospho-Chk1(Ser345)-20℃保存6個月后的樣本HEK293cells樣本降解，無目的條帶磷酸化蛋白檢測樣本制備——樣本保存VS陰性樣本確定背景信號：通過比較陰性樣本和實驗樣本的信號強度，可以區分真正的磷酸化信號和假陽性信號。驗證實驗特異性：如果在理論上不應該出現磷酸化的情況下（如未進行特定刺激或處理的樣本）檢測到了磷酸化信號，那么可能存在實驗方法的問題或者抗體的非特異性結合。這有助于確保實驗結果的準確性，避免誤判

。

陽性樣本驗證實驗有效：如果陽性樣本中沒有檢測到預期的磷酸化信號，那么可能是實驗過程中出現了問題，如抗體失效、實驗條件不合適等。通過陽性樣本的檢測，可以及時發現問題并采取相應的措施進行調整。提供參考標準：陽性樣本可以作為參考標準，幫助確定磷酸化信號的強度范圍和變化趨勢。33Phospho-Chk1(Ser317)AntibodyCat:111279-R0045Phospho-CREB(Ser133)AntibodyCat:110398-T40磷酸化蛋白檢測檢測關鍵點——設置陰陽性對照總蛋白抗體反映蛋白總量變化：確定磷酸化蛋白在總蛋白中的比例變化。排除非磷酸化因素影響：細胞內的許多因素，如轉錄水平調控、蛋白質合成與降解等，都可能影響蛋白的總量。通過檢測總蛋白，可以區分這些非磷酸化相關因素對蛋白表達的影響，更準確地判斷磷酸化修飾在特定生理過程中的作用。

Phospho-Chk1(Ser317)AntibodyCat:111279-R0045內參抗體標準化實驗結果：對不同樣品之間的蛋白上樣量、轉膜效率等實驗因素進行標準化，避免因實驗操作誤差導致的結果偏差。驗證實驗可靠性：內參抗體的檢測結果可以作為實驗質量控制的指標。Phospho-HER2/ErbB2(Tyr1221,

1222)AntibodyCat:111140-R002334磷酸化蛋白檢測檢測關鍵點——添加內參、總蛋白抗體35封閉液主要有2種，BSA和脫脂奶粉。檢測磷酸化蛋白建議使用BSA做封閉液降低非特異結合，減少背景干擾，提高信噪比影響抗體結合效率：合適的封閉液可以為抗體提供良好的結合環境；保持抗體活性奶粉中含有酪蛋白，產生高背景信號殘留的磷酸酶，影響磷酸化蛋白的檢測準確性奶粉批間一致差，不利于實驗的重復性封閉液的作用為什么不建議用奶粉？磷酸化蛋白檢測檢測關鍵點——封閉液36磷酸化蛋白豐度低，室溫孵育2h不易檢出，可4℃過夜孵育一抗，增加檢出率。充分反應：低溫能夠使抗體與目的蛋白之間有更充分的接觸和反應機會，提高結合的效率和特異性。減少非特異性結合：在較高溫度下，抗體可能會與非目的蛋白或其他雜質發生非特異性結合。增加結合量：長時間的孵育可以使更多的抗體結合到目的蛋白上，從而增加檢測信號的強度。穩定結合：低溫下抗體與目的蛋白的結合更加穩定，后續的洗滌和檢測步驟中減少信號的丟失。4℃過夜孵育的條件相對穩定，實驗的可重復性較好。增強信號強度可重復性好提高結合效率磷酸化蛋白檢測檢測關鍵點——4℃過夜孵育一抗去除非特異性結合降低背景噪音；提高特異性維持實驗條件穩定控制離子強度和pH值；防止蛋白降解提高實驗可重復性標準化實驗步驟；減少實驗誤差37洗液一般用TBST、PBST，檢測磷酸化蛋白建議使用TBST洗液離子強度影響PBST中的磷酸鹽緩沖液和氯化鈉可能會影響抗體與磷酸化位點的結合。pH值影響PBST的pH值可能對磷酸化檢測產生影響。如果pH值不合適，可能影響抗體的活性或蛋白質的穩定性，從而干擾檢測。洗液的作用為什么不建議用PBST？磷酸化蛋白檢測檢測關鍵點——TBST洗液SinoBiological,Inc.靶點概述：促進血管生成：VEGFR2(Tyr1175)在血管生成中扮演關鍵角色，其磷酸化激活后觸發信號傳導，促進新血管形成。腫瘤治療的潛在靶點：抑制VEGFR2(Tyr1175)活性可以阻斷血管生成信號，從而抑制腫瘤生長和擴散，目前有多款藥物在研。眼部疾病治療的希望：通過抑制VEGFR2(Tyr1175)，減少異常血管生成，保護視網膜，治療相關眼部疾病。單B細胞介入：單B細胞介入用經藥物刺激的HUVEC細胞裂解液進行篩選VEGFReceptor2(Tyr1175)靶點介入共檢測68個，其中13株強陽性，11株弱陽性。篩選結果如下圖：高特異性磷酸化抗體Phospho-VEGFReceptor2(Tyr1175)兔單抗（Cat#:111431-R0010）抗體篩選結果：3株陽性克隆。選取R0010進行大量生產，并進行WB特異性驗證HUVEC血清饑餓過夜后，VEGF(Cat#:11066-HNAH)50ng/ml2min，每個泳道30μg上樣量A:PositivecontrolantibodyB:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0004C:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0007D:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0010E:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0011F:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0013G:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0015H:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0017I:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0019J:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0020K:HPV16-SMCC-SinoA11431-R002239高特異性磷酸化抗體Phospho-VEGFReceptor2(Tyr1175)兔單抗（Cat#:111431-R0010）WB特異性驗證：天然樣品驗證

多肽阻斷HUVEC

磷酸酶處理膜HUVECHUVECPhospho-VEGFReceptor2(Tyr1175)兔單抗（Cat#:111431-R0010）抗體特異性識別磷酸化蛋白VEGFR2(Tyr1175)：磷酸化多肽可以阻斷抗體與細胞裂解的結合，磷酸酶處理膜后特異性磷酸化抗體和膜無結合40高特異性磷酸化抗體現貨磷酸化抗體貨號靶點109513-R0006mTOR(Ser2448)110547-R0002Akt(Thr308)109860-R00144E-BP1(Thr37/46)110565-R0009Chk1(Ser345)109859-R0016HistoneH2A.X(Ser139)110483-R0126HistoneH3(Ser10)111150-R0005PTEN(Ser380)110396-R0001p70S6Kinase1(Thr389)110591-R0113AKT(Ser473)110848-R0056AKT1(Thr450)110457-R0011eIF2α(Ser51)110441-R0072ERK1/2(Thr202,Tyr204)110455-R0016GSK3beta(Ser9)110435-R0004p38MAPK(Thr180,Tyr182)貨號靶點111378-R0002NF-κBp65(Ser536)111277-R0032Chk2(Thr68)111138-R0019IGF1R(Tyr1131)/InsulinReceptorβ(Tyr1146)110470-R0008MEK1/2(Ser217,221)111301-R0019cdc2(Tyr15)111168-R0044Stat6(Tyr641)111170-R0024PLCγ1(Tyr783)111421-R0003Paxillin(Tyr118)111461-R0007c-Jun(Ser73)111172-R0049PKCα(Thr638)PKCβII(Thr641)111160-R0021Stat5(Tyr694)111160-R0023Stat5(Ty