過氧化氫酶（CAT）活性分析試劑盒實驗解決方案原理過氧化氫酶（Catalase,CAT,EC）是一種常見的抗氧化酶，可催化過氧化氫（H2O2）分解為水和氧，普遍存在于含有細胞色素系統的好氧細胞中。過氧化氫對細胞是高度有害的，其積累將導致細胞靶標（例如DNA，蛋白質和脂質）的氧化，從而導致誘變和細胞死亡。通過使用過氧化氫酶從細胞中去除過氧化氫（H2O2），可以防止細胞的氧化損傷。過氧化氫酶在氧化應激相關疾病中的作用已被廣泛研究。過氧化氫酶還表現出過氧化活性，其中低分子量醇可用作電子供體。脂肪醇是過氧化氫酶的特異性底物，然而，具有過氧化活性的其它酶不利用這些底物。CheKine?過氧化氫酶(CAT)活性分析試劑盒（微量法），提供了一種簡單易用的微量法，用于分析不同生物樣品（血清、血漿、細胞/組織裂解液、生物液體）中過氧化氫酶活性。該檢測試劑盒利用過氧化氫酶的過氧化物酶功能來測定過氧化氫酶的活性。在合適濃度的H2O2存在的條件下，過氧化氫酶與甲醇反應，產生甲醛，生成的甲醛可以與顯色物反應，產物可以在540nm處測量吸光度，樣本中的過氧化氫酶活性與OD值成正比。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測540nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭·水浴鍋，離心機·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備1×AssayBuffer:AssayBuffer(10×)用去離子水稀釋至1×AssayBuffer。取2mLAssayBuffer(10×)加入18mL去離子水稀釋至1×AssayBuffer，可在4℃保存至少兩個月。1×SampleDiluent:SampleDiluent(10×)用去離子水稀釋至1×SampleDiluent。取5mLSampleDiluent(10×)加入45mL去離子水稀釋至1×SampleDiluent，可用來稀釋FormaldehydeStandards，Catalase(Control)和樣本，可在4℃保存至少兩個月。1×LysisBuffer:Lysisbuffer(10×)用去離子水稀釋至1×LysisBuffer。取5mLLysisbuffer(10×)加入45mL去離子水稀釋至1×LysisBuffer，可在4℃保存至少兩個月。Methanol:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。FormaldehydeStandard:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：FormaldehydeStandard有毒性，實驗時請佩戴口罩手套等防護措施。DilutedCatalase(Control):該瓶含有牛肝臟CAT粉末，作為陽性對照。用0.5mL1×SampleDiluent復溶并混合（復溶的酶可在-20℃保存一個月）。取10μL已經復溶的酶，用4.99mL1×SampleDiluent工作液稀釋（稀釋的酶可4℃保存30min）。PotassiumHydroxide:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。DilutedHydrogenPeroxide:用9.96mL去離子水稀釋40μLHydrogenPeroxide。DilutedHydrogenPeroxide可于冰上保存2h。Chromogen:即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃避光保存。PotassiumPeriodate:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：PotassiumPeriodate具有強氧化性，與可燃物料接觸可能引起火災。標準品制備：用9.99mL1×SampleDiluent稀釋10μLFormaldehydeStandard，得到4.25mM的儲存液。按下表所示，進一步稀釋標準品。StandardFormaldehyde(μL)1×SampleDiluent(μL)FinalConcentration(μMFormaldehyde)1499622109905330970154609403059091045612088060715085075注意：Finalformaldehydeconcentration是指在170μL反應體系里的終濃度。樣本制備動植物組織：稱取0.1g組織加入1mL預冷的1×Lysisbuffer將樣本進行勻漿。勻漿后的樣本，10,000g，4℃離心15min，取上清液做進一步分析。細胞：收集5×106個細胞加入1mL預冷的1×Lysisbuffer，冰上勻漿，10,000g，4℃離心15min，取上清液做進一步分析。血清、血漿：按常規方法收集血清，1×SampleDiluent稀釋后即可作為血清樣本進行檢測；用抗凝管收集血液，顛倒混勻。600g，4℃離心10min，移取上清至另一新的離心管中，適量1×SampleDiluent稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。處理好的樣本須當天檢測。測定過程中樣本在冰上放置，以免變性和失活。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調節波長至540nm，可見光分光光度計用去離子水調零。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：試劑 空白孔（μL）標準孔（μL）測定孔（μL）陽性對照孔（μL）1×AssayBuffer100100100100Methanol303030301×SampleDiluent20000Stds02000Sample00200DilutedCatalase(Control)00020DilutedHydrogenPeroxide20202020充分混勻，室溫孵育20minPotassiumHydroxide30303030Chromogen30303030充分混勻，室溫孵育10minPotassiumPeriodate10101010充分混勻，室溫孵育5min，立即測定540nm處的吸光值A。計算ΔA測=A測定-A空白，ΔA標=A標準-A空白。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.001可適當加大樣本量。如果ΔA大于0.8，樣本可用1×SampleDiluent進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算標準曲線繪制：以標準溶液Finalformaldehydeconcentration(μM)為y軸，ΔA標為x軸，繪制標準曲線（濃度為y軸更方便計算結果）。根據標曲計算樣本產生的甲醛濃度Formaldehyde(μM)=y×(0.17mL÷0.02mL)=8.5×y再計算CAT的酶活，1個酶活單位定義為：25℃環境下，每分鐘產生1.0nmol甲醛的酶的量按樣本蛋白濃度計算CATActivity=μMofSample÷(20min)÷Cpr×Sampledilution=0.425×y÷Cpr×Sampledilution(nmol/min/mgprot)按液體體積計算CATActivity=μMofSample÷(20min)×Sampledilution=0.425×y×Sampledilution(nmol/min/mL)按樣本鮮重計算CATActivity=μMofSample÷(20min)÷W×Sampledilution=0.425×y÷W×Sampledilution(nmol/min/g)細胞數量計算CATActivity=μMofSample÷(20min)÷cellsnumber×Sampledilution=0.425×y÷500×Sampledilution(nmol/min/104cells)W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞總數，500萬。Formaldehyde(μForma