數字PCR技術及應用數字PCR是繼實時定量PCR之后新興發展起來的一種絕對定量分析技術。通過將單個DNA分子轉移入獨立的反應室，PCR擴增反應后，對熒光信號進行檢測分析，實現單分子的絕對定量。數字PCR技術擺脫了對標準曲線的依賴，具有更高靈敏度和準確度，在基因突變檢測、拷貝數變異檢測、微生物檢測、轉基因食品檢測以及下一代測序等方面均得到廣泛應用。1999年，美國學者KennethKinzler與BertVogelstein首次提出了“數字PCR(DigitalPCR，dPCR)”的概念，該技術實現了核酸拷貝數絕對定量的突破。其主要特點在于將目標分子分散入單個反應室中，使每個反應室中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子，是實現數字PCR高靈敏度和高準確度的關鍵。1技術原理數字PCR主要原理是將單個DNA分子置于獨立的反應室中，幵對其迚行PCR擴增，利用TaqMan?化學試劑及染料標記探針檢測特定的靶序列，通過呈現兩種信號類型的反應單元比例和數目進行統計學分析，實現樣品的絕對定量。因此，數字PCR也稱單分子PCR，其檢測過程主要包括兩部分內容，即PCR擴增和熒光信號分析。在PCR反應前，將樣品分散至幾萬個單元(反應室)中，使每個單元中只存在單個DNA分子。PCR擴增階段的擴增程序、擴增體系與普通PCR幵沒有什么不同。在熒光信號分析階段，采用終端檢測，是對每個反應單元的熒光信號迚行采集，然后直接計數或者借用泊松統計得到樣品的原始濃度或含量(圖1)。與實時熒光定量PCR不同的是，整個數字PCR過程不需要擴增標準曲線和看家基因，具有良好的準確度和重現性，可以實現真正意義上的絕對定量。基于分液方式的不同，數字PCR主要分為3種：微流體數字PCR(MicrofluidicdigitalPCR，mdPCR)、微滴數字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)和芯片數字PCR(ChipdigitalPCR，cdPCR)。分別通過微流體通道、微液滴或微流體芯片實現分液，分隔開的每個微小區域都可進行單獨的PCR反應，其中mdPCR基于微流控技術，對DNA模板進行分液，微流控技術能實現樣品納升級或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應體系結合，mdPCR已逐漸被其他方式取代；ddPCR技術，是相對成熟的數字PCR平臺，利用油包水微滴生成技術，目前的儀器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系統和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統，其中Bio-rad公司的dPCR系統利用油包水生成技術將含有核酸分子的反應體系生成20000個納升級微滴，經PCR擴增后，微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測；cdPCR利用微流控芯片技術將樣品的制備、反應、分離和檢測等集成到一塊芯片上，目前的儀器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark?基因分析系統和LifeTechnologies公司的QuantStudio系統。利用集成流體通路技術在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動來實現生物樣品的分液、混合、PCR擴增，實現絕對定量。2數字PCR的優勢傳統PCR技術是將目的基因經過PCR擴增循環，一個DNA分子模板復制成成千上萬的子代雙螺旋，然后用凝膠電泳進行檢測。但是，凝膠電泳檢測只能對擴增產物的分子大小進行判斷，而無法推斷出起始樣品中DNA的含量，因此無法進行定量分析；實時熒光定量PCR可以進行絕對定量和相對定量，其中絕對定量是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量，標準品可選擇純化的質粒DNA或體外合成的ssDNA等，相對定量通過內參等進行換算起始樣品中DNA的相對含量。數字PCR是基于傳統PCR、實時熒光定量PCR基礎上發展起來的第3代PCR技術，它不需要標準品，也不要制作標準曲線，即能實現更靈敏、更準確的絕對定量。數字PCR高精確度的另一個重要因素是將泊松統計引入數字PCR的檢測應用中。由于數字PCR是一種終端檢測的分析方法，如果目標分子沒有得到很好的離散，在一個反應室中不止存在一個靶DNA，那么得到的濃度便不可信。泊松統計是對隨機分布的一種描述方法，當反應室/液滴量和其中陰性比例已知，即可通過泊松模型獲得初始濃度。所以，如果反應室沒有達到飽和，研究者也可以計算樣品的起始分子數。Beer等的研究表明，基于液滴方法的優勢在于其可擴大性，增加反應容器的數量，數據的質量也就隨之增大。即當擴大或增加了反應容器的數量時，泊松精度也隨之提升。同時，數字PCR能夠有效避免反應抑制劑的影響。隨著反應室的增加，反應受到抑制劑的影響就越小。3數字PCR的應用據KaloramaInformation發布的研究報告顯示，2019年全球數字PCR和qPCR市場預計將達到39.7億美元，中國是最主要的新興市場。3.1在突變檢測方面的應用常規組織和血液等樣品中，由于單個突變的體細胞含量低，使得檢出其的存在變得困難。而dPCR可對復雜的大背景進行有限的稀釋或分區，通過有限稀釋，降低野生基因型的背景信號，使得低豐度的目的序列能夠被靈敏的檢出，特別適用于稀有突變的檢測應用。研究表明，低至1/100000的變異頻率能被檢測出來。并且隨著反應室數量的增加，對稀有變異的分析更靈敏。dPCR在稀有突變檢測方面有廣泛的應用和研究，尤其是與癌癥相關的檢測和定量研究，如EGFR、BRAF、KRAS、PIK3CA、JAK2和miRNAs等。PIK3CA可由IGF-1、HGF、EGF等生長因子激活，與生長因子一同作用于受體酪氨酸激酶，促進增殖、血管生成和細胞的新陳代謝。Kim等用ddPCR對血清中游離的DNA進行PIK3CA突變的檢測分析，血清中低豐度的PIK3CA突變成功被檢測出來。對38份轉移性膽道癌樣品進行試驗，匹配的一份血清樣品PIK3CAp.E542K對28突變拷貝呈陽性，相當于48copies/mL血清和0.3%的等位基因的患病率；另一血清樣品PIK3CAp.H1047R對10突變拷貝呈陽性，相當于18copies/mL血清和0.2%的等位基因的患病率。Miotto等研究表明EvaGreen染料法和TaqMan探針法均可用于人體血漿和血清中循環miRNA的ddPCR檢測定量。3.2在拷貝數變異檢測方面的應用通?；虮磉_分析依賴于瓊脂糖凝膠電泳、realtimePCR等方法，拷貝數的確定總是受到限制。而使用dPCR進行直接計數目標基因和參照基因的雙重反應，通過計算比值，便直接得到目標基因的拷貝數。影響HIV感染和疾病進展的CCL3編碼基因拷貝數變異(Copynumbervariations，CNV)的發現引起廣泛的爭議，已經在一定程度上歸因于拷貝數評估方法獲得的不同結果。CCL3基因編碼CC趨化因子CCL4，也是CCR5受體的自然配體，對HIV-1起到了保護作用。Bharuthram等用標準方法qPCR和ddPCR對CCL4L基因拷貝數進行評估測定。研究表明，與qPCR(r=0.87，P<>相比，由ddPCR測得CCL4L拷貝與CCL4L1和CCL4L2拷貝之和具有良好的相關性(r=0.99，P<>。而qPCR在高拷貝數時出現準確性明顯下降。Whale等模擬不同CNVs的HER2基因擴增，相同試驗條件下，dPCR能夠檢測比qPCR更低的CNVs。由于dPCR準確度與擴增大小和模板濃度是直接相關性的，他們也建立了用于測量CNV的dPCR方法。利用泊松和二項分布，得出dPCR的方差表達式。3.3在微生物檢測方面的應用核酸擴增技術是病原微生物檢測的一個重要方法，但可能存在的問題是，有時候低水平目標分子和小分子抑制劑的存在使得檢測定量的結果發生偏移。dPCR則是一種不需要標準曲線并且對部分抑制劑不靈敏的檢出方法。因此，研究人員紛紛將其應用于一些病毒或致病菌的檢測研究中，如HBV、腸病毒、腺相關病毒、巨細胞病毒、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、結核分支桿菌、產志賀毒素大腸桿菌等。Strain等采用ddPCR和qPCR對HIV經過聯合抗逆轉錄病毒療法治療的病人體內殘留的DNA進行檢測，研究發現，ddPCR具有更高的精確度和更低的拷貝變異系數。Dong等對E.coliO157:H7的rfbE基因建立ddPCR，優化探針濃度，在20μL體系中，對E.coliO157:H7基因組DNA的檢測范圍為4?1.25×105copies，線性相關系數為0.999。同時用ddPCR和qPCR對16份實際樣品進行檢測得到相同結果。在環境檢測方面，dPCR也得到相應的應用。Josefa等在對土壤、植物根莖樣品中煙草疫霉菌的低拷貝DNA定性定量的研究發現，與qPCR相比，dPCR對反應抑制劑更不敏感。由于基于標準曲線的realtimePCR方法在檢測方面帶來的偏差，Cao等利用雙重ddPCR同時檢測糞源和水質中的腸球菌和人源糞便相關標記HF183。qPCR中雙重的腸球菌和HF183相互競爭使得其無檢出或超出其單重最低檢測濃度范圍，而ddPCR的單重和雙重檢測結果一致。其對抑制劑的較高耐受性、重復性、檢測靈敏度以及準確度均比qPCR高，但是其定量上限較realtimePCR低。Anja等將ddPCR與qPCR聯合起來使用，用ddPCR制備標準曲線，用realtimePCR進行定量，成功實現對不同生物膜形成時期的單增李斯特菌定量檢測。3.4在轉基因食品檢測方面的應用歐盟國家對轉基因食品有著嚴格的限定，而目前，一般采用實時定量PCR用于商品中轉基因的分子定量分析。但是在一些復雜的食物原料和飼料原材料中，目標DNA非常少，使得對其的檢測和定量受到限制。dPCR為國內外研究人員提供了新的方法。Morisset等用ddPCR對MON810轉基因和hmg玉米參考基因進行絕對定量。研究表明，ddPCR對低濃度的檢測具有更高的重復性，并且對抑制劑具有更高耐受性。Dobnik等用多重ddPCR檢測定量12個歐盟授權轉基因玉米，對于含轉基因組織樣品中，該方法比實時定量PCR更高通量、更高效。Damira等建立雙重ddPCR用于檢測定量轉基因玉米中T-nos/hmg基因的拷貝數比例，通過中心復合設計優化，并在體系中加入DNA消化酶減小檢測偏差，所建立的方法T-nos檢測限為11拷貝，T-nos/hmg比例的動態范圍為0.08%–100%。3.5在下一代測序方面的應用下一代測序(NGS)又叫高通量測序，是測序技術革命性的進步，能一次上百萬條DNA分子進行序列測定，使得對一個物種的轉錄組和全基因組進行細致全貌的分析成為現實。dPCR平臺可以與NGS對接，實現對測序文庫的質量控制、提供對測序文庫的定量分析和質量評估信息。一方面，dPCR對NGS的測序結果進行驗證，對諸如單核苷酸多態性，突變及拷貝數變異在內的基因組變異進行驗證，確保測序結果的可信度；另一方面，所得到的結果還包含反映測序文庫質量的信息，如接頭與接頭二聚體、錯誤連接片段、過長連接片段等，這是當前其他方法所不具備的優勢。Alikian等研究表明，在慢性粒細胞白血病患者的檢測中，dPCR比qPCR更準確，定量分析結果可靠性高、重復性好。dPCR與普通PCR、qPCR相比具有獨特的技術優勢，實現了單分子DNA絕對定量，使其成為了分子生物學研究中的重要工具，研究者對其應用分析也日益關注。近期，相應的分析軟件有所突破，美國已推出一款ddpcr軟件可用于使用者分析dPCR數據，免費在線網址為/shiny/ddpcr/。軟件及網站的建立為dPCR技術的推廣和應用提供重要支持。未來如果能有效解決