野鯉種質鑒定微衛星法2013-12-18發布2013-12-31實施吉林省質量技術監督局發布I本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規則起草。本標準由吉林省水利廳提出并歸口。本標準起草單位：吉林省水產科學研究院。本標準主要起草人：鄭偉、閆春梅、毛瑞鑫、陳偉強、王戰蔚、王文蘭、杜曉燕、李忠強、李秀穎、常淑芳、李永利。14原理5試劑25.2無水乙醇。5.4TaqDNA聚合酶：-20℃保存。5.5分子量標準(Markers):DL2000。5.6溴化乙錠(EB)。5.9300g/L丙烯酰胺溶液：20mL水中融解29g丙烯酰胺，1g甲叉雙丙烯酰胺，定容至100mL,4℃5.105×Tris硼酸(5×TBE)電泳緩沖液：Tris27g,硼酸13.75g,加蒸餾水400mL溶解后，加入0.55.11100g/L過硫酸銨：8mL水中溶解1g過硫酸銨，加水至10mL,4℃保存，現用現配。5.121g/L硝酸銀(AgNO?)染色液：將AgNO?0.5g溶于超純水450mL,加ddH?O定容至500mL,5.13裂解液：5g/L十二烷基肌胺酸鈉，10mmol/LEDTA(5.15提取液：Tris飽和酚+氯仿+異戊醇(25+24+1,體積比)。5.16乙醇溶液：乙醇+水(7+3,體積比)。5.20微衛星引物：參見附錄A。6儀器6.1電子天平：精度0.0001g。6.4水浴恒溫震蕩器：溫控范圍RT-100℃,控溫精度±1℃。6.8凝膠成像分析系統。38試驗步驟取20mg鰭條加入0.6mL裂解液，55℃溫育1-2h,并不時輕搖至組織塊完全消化，取上清液用提取液抽提3次，加入無水乙醇1ml于-20℃過夜沉淀，離心，棄去上清液，再用0℃預冷的乙醇溶液洗滌1次，自然干燥后加50-100μL1×TE(pH8.0)溶解DNA,4℃保存備用。8.2.1DNA純度測定吸取1-3μL提取的DNA,用濃度10-20g/L瓊脂糖凝膠100V電泳30min,檢測所提取DNA的質量。以DNA條帶的分子量及有無拖尾為標準判斷DNA的質量。分別于260nm波長和280nm波長下測定產物(或產物稀釋液)的紫外吸收值。確定Azgo/A?s比值在1.8-2.0范圍內，方可正常進行后續實驗。8.2.2DNA濃度測定取適量8.2.1測定后產物，于260nm波長測定紫外吸收值，并根據公式(1)計算產物DNA濃度。L比色池厚度，單位為厘米(cm);稀釋倍數檢測前DNA吸光度值達到允許范圍0.1-0.8時所需要稀釋的倍數。8.3微衛星引物配制取附錄A所列17種微衛星引物用水配制成濃度為50pmol溶液，4℃保存備用。8.4.1PCR反應體系PCR反應體積均為15μL,PCR反應體系組成見表1。4反應體系正向引物(2pmol/μL)反向引物(2pmol/μL)8.4.2PCR反應程序表2微衛星標記——PCR反應程序階段溫度時間1230個循環348.5PCR產物的聚丙烯酰胺凝膠檢測58.5.3制膠將配制的52mL300g/L丙烯酰胺溶液中加入40mL5×TBE和107mL蒸餾水，15μLTEMED,用攪棒混勻溶液(不得有氣泡),將制好的膠板斜放45度角，然后用玻棒引流緩緩灌緩慢移去膠板底端的塑料封口槽，將膠板帶凹口面向內裝到電泳槽上，用彈簧夾夾緊膠模。用1×加完后，在預留的樣品槽點入DL2000markers,將電源連接，120V恒壓電泳。當指示劑跑到膠板底部時，結束電泳，將電源電壓調至為“O”,再關閉電源開關。取下凝膠板心去掉膠板兩側的隔板后在蒸餾水中輕輕撬開兩片玻璃板取下凝膠，用蒸餾水洗膠30s,再將凝膠置于1g/L硝酸銀染色液中染色10min,型(如AA,AB,AC或BB等),建立各個群體的等位基因型數據陣列。8.7.2結果分析利用群體遺傳學分析軟件