DB2102DB2102/T0005—2020海帶配子體采苗及育苗技術規程TechnicalSpecificationforGametophyteclonalbreedingofSaccharinajaponica2020-10-29發布2020-11-29實施大連市市場監督管理局發布I本標準按照GB/T1.1—2020給出規則起草。本標準由大連市農業農村局提出并歸口。本標準主要起草單位：大連海寶漁業有限公司。本標準主要起草人：冷曉飛、張喜昌、劉劍波、孫穎、許淑芬。本標準發布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門：大連市農業農村局通訊地址：大連市西崗區新開路87號聯系電話準起草單位：大連海寶漁業有限公司通訊地址：遼寧省大連市旅順口區鐵山街道柏嵐子村1號聯系人：劉劍波聯系電話：187411667751海帶配子體采苗及育苗技術規程本標準規定了海帶配子體采苗及育苗的環境與水質、設施、配子體擴增培養、配子體育苗和苗簾出庫、運輸。本標準適用于大連地區室內海帶配子體采苗及育苗。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，標注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY5052無公害食品海水養殖用水水質NY5362無公害食品海水養殖產地環境條件SC/T2024種海帶3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。形成配子進行有性生殖世代的藻體(核相n)。4環境與水質育苗場址應選擇遠離城市污水和工業污水排放口，附近沒有大型河流入海，巖石或砂質底質的沿海區域，其它環境條件應符合NY5362的規定，水質應符合NY5052的規定。5.1擴增培養室用于配子體的擴增培養，應為配有制冷設施的保溫室，內設培養臺架和充氣設備，臺架層高50cm,5.2育苗室2育苗室設置應為溫室結構，以東西走向為宜。屋頂下設置可拉伸的黑色和白色布簾各一層，窗口設深色布簾。育苗池呈平面并聯式，單池規格10m×1.4m×0.5m。池內設攪拌機保持循環水流。5.3供排水系統包括泵房、沉淀池、砂濾罐(塔)、儲水池、回水池等。5.4制冷系統包括集成式制冷機、制冷槽、砂濾罐、回水槽等。6配子體擴增培養6.1配子體準備6.1.1游孢子采集與配子體培育在海帶成熟季節，參照SC/T2024的規定選擇種海帶。用消毒剪刀剪下3cm×3cm含有孢子囊的藻體，以滅菌紗布蘸消毒海水清洗藻體表面浮泥雜藻，陰干1h~3h后，轉移到盛有消毒海水的燒杯中放散游孢子。5min后鏡檢，視野(×100)中游孢子數量達到10個～20個以上時，取中上層孢子液，接種到多個加有培養液的消毒培養皿中培養20d,獲得配子體。培養條件為溫度15℃~20℃,光照5001x~10001x,光周期L:D=12h:12h。培養液為滅菌海水中添加NaNO?-N10mg/L,KH?PO?-P2mg/L,F/2培養基16.1.2配子體雌雄分離與保種用微細管分離法分離雌雄配子體，分別移到數個直徑18cm盛有培養液的培養皿內培養。培養條件為：溫度15℃~20℃,光照5001x~10001x。當配子體生長至布滿培養皿底面時，將雌雄配子體用消毒毛刷刷下，轉移到50ml透明試管中，在溫度4℃~8℃,光照低于501x條件下儲藏保種。每月更換一次培養液。培養液為在滅菌海水中添加NaNO?-N10mg/L,KH?PO?-P2mg/L。6.2配子體擴增配子體擴增應在采苗前6個月進行，在適宜的培養條件下，擴增后的配子體生物量每月可翻一倍。采苗時，一個苗簾需求雌雄配子體各0.5g,因此，可根據苗簾數確定配子體需求量和擴增時間。6.3配子體擴增操作將低溫儲藏的雌、雄配子體分別移入組織搗碎機中，加滅菌冰海水至1000ml,16000r/min切碎30s后，按1g/L~1.5g/L的密度，分別接種于5L三角燒瓶中培養。6.4擴增培養條件應符合以下要求：——擴增培養用海水應為煮沸消毒的砂濾海水；——培養液溫度應控制在15℃~20℃;——光照應控制在10001x~15001x,光周期L:D=12h:12h;——培養瓶應24小時連續充氣；——新培養液中營養鹽濃度應為NaNO?-N10mg/L,KH?PO?-P2mg/L;——更換培養液或接種前，操作人員雙手和器具應消毒。36.5擴增培養管理6.5.1更換培養液培養液2周更換一次，更換前應停止充氣，使配子體自然沉降于燒瓶底部，將燒瓶中上層的舊培養液倒出。配子體量較多時，用300目篩絹收集倒出的配子體。6.5.2分瓶擴增培養配子體生長至15g/L～20g/L時應分瓶培養。若配子體呈絮狀，直接分瓶培養。若配子體呈簇團狀，用300目篩絹濾出配子體，轉入組織搗碎機，加滅菌冰海水至1000ml,16000r/min切碎30s后，分瓶擴增培養。7配子體育苗7.1采苗前準備7.1.1苗簾的組裝應按以下要求進行：——使用聚乙烯材質規格為68cm×34cm長方形框架，上纏直徑3.0mm~4.0mm,混紡1根～3根聚乙烯絲的白色維尼綸繩，繩不宜纏得過緊，每簾用繩37m;——苗簾使用前需用噴燈將苗繩上的細毛烤掉，且使用三道聚乙烯繩均勻的固定好苗簾繩；——苗簾4簾一組，水平并列綁縛到兩根長1.4m的PVC圓管上。7.1.2育苗池處理每個育苗池2個長池壁內側距池底20cm處，設置托架，用于托放成組的苗種簾。7.2.1采苗時間可根據海區養殖季節來確定，多在8月中旬。7.2.2配子體切碎用滅菌的300目篩絹網收集擴增培育養的配子體。每次取50g配子體，轉移到組織搗碎機，加滅菌冰海水至1000ml,16000r/min切碎120s,經400目篩絹過濾，未濾出的配子體細胞段繼續切碎過濾。重復切碎4次后，將搗碎機中的配子體細胞段混合到前三次的濾液中備用。把備好的海帶苗種簾逐組擺放到育苗池壁托架上，9℃~11℃低溫海水浸泡預冷，池水沒過苗種簾6cm~8cm。將雌、雄配子體細胞段按照破碎前濕重的1:1混合，用5℃~6℃低溫海水稀釋，按照1g/簾的配子體用量，均勻潑灑在苗種簾上方的水面，使配子體細胞段沉降到苗種簾上，靜水附著72h,水溫9℃~13℃。7.3幼苗培育管理7.3.1水流、水溫及換水量4附苗72h后正常流水，流速5cm/s~10cm/s,水溫9℃~11℃。每日補新水。幼孢子體規格在0.3mm之前，日補水量30%,規格在0.3mm~10mm時，日補水量60%,規格在10mm以上，日補水量100%。7.3.2光照及營養鹽配子體期，光照不高于20001x,營養鹽NaNO?-N3mg/L,KH?PO?-P0.6mg/L,F/2培養基0.3mg/L;幼孢子體前期，規格在0.5mm之前，光照不高于35001x,營養鹽NaNO?-N3mg/L,KH?PO?-P0.3mg/L,FeCH?Oz-Fe·5H?O0.02mg/L;幼孢子體后期，規格在0.5mm之后，光照不高于70001x,營養鹽NaNO?-N附苗20d內不洗涮苗簾；附苗20d后，每3d洗刷苗簾1次。7.3.4病害及防治應符合表1的要求。表1育苗期間主要病害及防治方法病因防治方法長脖子病嚴重，葉片失去光澤。多為幼苗密度大，光照不足。(1)增加洗刷苗簾的次數；(2)適當提高光照強度；(3)降低水溫。綠爛病葉片從尖端開始變綠、變軟，逐漸腐爛脫落。多為光照不足。(1)適當提高光照強度；(2)增加補水量，加大流速；(3)降低水溫；(4)白尖病細胞脫落掉。多為突然受強光刺