生物大分子相互作用

的研究方法三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院盛德喬shengdq@世界上只有一種疾病，那就是——基因表達(dá)異常

RogerJ.Williams

(NutritionAgainstDisease:EnvironmentalPrevention1971

)核酸和蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的生物活性大分子，各自有其結(jié)構(gòu)特征和特定功能，是生命活動的主要組成部分。兩者的相互作用構(gòu)成了諸如生長、繁殖、運(yùn)動、遺傳和代謝等生命活動。HGP完成之后，大量的基因被發(fā)現(xiàn)和定位，基因功能的研究成為分子生物學(xué)研究的中心問題之一。轉(zhuǎn)錄因子與特定DNA元件結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)—核酸基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物EGF信號傳導(dǎo)通路蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用傳遞信息蛋白質(zhì)—DNA相互作用產(chǎn)生效應(yīng)蛋白質(zhì)和核酸的相互作用——參與了很多體內(nèi)的生物學(xué)過程，弄清DNA-蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制，對我們了解DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達(dá)機(jī)制，揭示各種生命活動現(xiàn)象具有極其重要的指導(dǎo)作用。蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)間的相互作用——蛋白質(zhì)是細(xì)胞活性及功能的最終執(zhí)行者，每個蛋白質(zhì)并不是獨立地行使其功能，它們在細(xì)胞中通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成大的復(fù)合體，在特定的時間和空間內(nèi)完成特定的功能。DNA-蛋白質(zhì)相互作用

的研究方法蛋白質(zhì)和核酸的相互作用參與了很多體內(nèi)的生物學(xué)過程，弄清DNA-蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制，對我們了解DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達(dá)機(jī)制，揭示各種生命活動現(xiàn)象具有極其重要的指導(dǎo)作用。/method/methods-detecting-protein-dna-interactions研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)有很多，包括：DNaseI足跡試驗電泳遷移率變動實驗(EMSA)酵母單雜交技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）ChIP-Sequence技術(shù)甲基化干擾試驗噬菌體展示技術(shù)核酸適體技術(shù)等等。1.DNaseI足跡試驗蛋白質(zhì)結(jié)合在DNA片段上，能保護(hù)結(jié)合部位不被DNase破壞，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段(亦稱“足跡”)，進(jìn)而可以確定它的序列。在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒有放射性標(biāo)記條帶。DNaseI足跡試驗是一種鑒別RNA聚合酶等蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的方法，它不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白，而且能告知目標(biāo)蛋白結(jié)合在哪些堿基部位。足跡試驗的方法較多，常用的有DNaseI足跡試驗和硫酸二甲酯足跡試驗(dimethylsulfate，DMS)，兩者原理基本相同。DNaseI足跡試驗的實驗流程如下：待檢雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，通常只標(biāo)記一端；蛋白質(zhì)與DNA混合，等兩者結(jié)合后，加入適量的DNaseI，消化DNA分子，控制酶的用量，使之達(dá)到每個DNA分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，并列設(shè)置未加蛋白質(zhì)的對照；從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA加樣在測序凝膠中作電泳和放射性自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。精確控制酶量Actualexperimentalresults.Lanes1–4containedDNAboundto0,10,18,and90pmolofprotein,respectively(1pmol=10–12mol).TheDNAsequencewasobtainedpreviouslybystandarddideoxysequencing.2.電泳遷移率變動實驗

電泳遷移率變動實驗(electrophoresismobilityshiftassay,EMSA)又稱凝膠阻滯實驗，是一種簡單、快速和靈敏的體外檢測DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。驗證！基本原理——在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了，導(dǎo)致在聚丙烯酰胺凝膠電泳上發(fā)生阻滯，形成滯后帶。EMSAAdouble-stranded

oligonucleotide

containigaNF-B-bindingsiteislabeled

witharadioactiveisotopeandincubated

withanuclear

extract.During

gel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.NF-BFreeProbeRadioaktivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)and

bound

NF-B

RadioactivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)Nuclearextract

ofnon-activated

cellsNuclearextractofactivated

cellsEMSA的主要實驗步驟：探針制備(設(shè)計、合成、標(biāo)記、純化、退火)具體實驗設(shè)計核蛋白(?)制備及濃度測定EMSA操作實驗時競爭設(shè)計!凝膠阻滯試驗一定要排除非特異結(jié)合。其方法是在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系中，加入超量的非標(biāo)記的競爭DNA(competitorDNA/冷探針)。如果它與同位素標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的是同一種蛋白質(zhì)，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分蛋白質(zhì)都會被其競爭結(jié)合掉而使探針DNA仍處于自由的狀態(tài)，所以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現(xiàn)阻滯的條帶。探針突變？抗體超遷移檢測（antibodysupershiftassay）是在凝膠阻滯實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展而來。在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系中加入抗目的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的特異抗體。由于抗體的結(jié)合，使DNA-蛋白質(zhì)-抗體的分子量增加，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率進(jìn)一步降低，出現(xiàn)“超遷移帶”。

3.酵母單雜交

yeastone-hybridsystem

EMSA技術(shù)是一種簡單和靈敏的檢測DNA-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，但它不能發(fā)現(xiàn)新的DNA-蛋白質(zhì)的相互作用。（只能驗證！）酵母單雜交技術(shù)不僅能驗證和檢測已知的DNA-蛋白質(zhì)相互作用，還能篩選、發(fā)現(xiàn)新的DNA-蛋白質(zhì)相互作用。1993年建立以來，應(yīng)用酵母單雜交體系已經(jīng)驗證了許多已知的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，同時發(fā)現(xiàn)了新的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，并由此找到了多種新的轉(zhuǎn)錄因子。基本原理——真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個DNA特異性結(jié)合功能域和一個或多個其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。BD有特異性AD沒有特異性（可獨立起作用）用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達(dá)的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)需包含：文庫蛋白的編碼基因與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA

文庫質(zhì)粒；含目的基因與下游報告基因的報告質(zhì)粒。其中，文庫的設(shè)計和篩選實驗是整個酵母單雜交系統(tǒng)的核心技術(shù)。Element元件串連四聚體插入報告基因質(zhì)粒ADcDNA文庫質(zhì)粒載體構(gòu)建含有元件核心序列的報告基因質(zhì)粒將報告基因質(zhì)粒整合到Y(jié)M4271菌株檢測各種報告基因的背景表達(dá)雙重報告基因菌株構(gòu)建MATCHMAKERcDNA文庫的擴(kuò)增利用雙重報告基因菌株篩選文庫陽性克隆的分離與鑒定篩選所得陽性質(zhì)粒測序及BLAST分析酵母單雜交體系主要有以下3種用途：確定已知DNA—蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用；分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因；定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。4.染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmuno-precipitationassay,ChIP)是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，它能真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的最好方法。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)基本原理在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲波將染色質(zhì)打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復(fù)合體。只有與目的蛋白結(jié)合的DNA片段才能夠被沉淀下來，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括：細(xì)胞固定染色質(zhì)斷裂染色質(zhì)免疫沉淀解交聯(lián)反應(yīng)DNA的純化DNA的鑒定ChIP利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarosebeads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)ChIP

流程圖ChIP-chip技術(shù)Biotechniques.2007December;43(6):791–797.5.ChIP-Seq技術(shù)ChIP-Seq技術(shù)是將染色質(zhì)免疫共沉淀獲得的微量DNA片斷進(jìn)行大規(guī)模測序。通過免疫共沉淀得到目的DNA（>10ng,200bp左右），將獲得的DNA片段加上接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ChIP-Seq

文庫后直接進(jìn)行大規(guī)模測序。ChIP-Seq是繼ChIP-ChIP后，蛋白/核酸相互作用研究的又一技術(shù)突破。實現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)更精確、更敏感、更經(jīng)濟(jì)的定位目蛋白所有的結(jié)合位點。主要步驟常規(guī)的染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)，獲得目的DNA片段；DNA片段的末端修復(fù)，將‘A’堿基加入到DNA片段的3‘末端；DNA片段末端加上接頭；PCR擴(kuò)增加上接頭的DNA片段；DNA在ClusterStation成簇擴(kuò)增；IlluminaGenomeAnalyzer上的測序；生物信息學(xué)分析。染色質(zhì)免疫共沉淀↓目的DNA片段↓DNA片段的末端修復(fù)↓將‘A’堿基加入到DNA片段的3‘末端↓DNA片段末端加上接頭↓PCR擴(kuò)增加上接頭的DNA片段↓文庫檢測↓DNA在ClusterStation成簇擴(kuò)增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的測序↓生物信息學(xué)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

的研究方法研究蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)有很多，包括：GST融合蛋白進(jìn)行Pulldown實驗免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)酵母雙雜交Co-IP—質(zhì)譜蛋白質(zhì)芯片技術(shù)熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)噬菌體展示技術(shù)等等1.GST融合蛋白進(jìn)行Pulldown實驗融合蛋白pull-down技術(shù)基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose),當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過該基質(zhì)時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有被吸附的“雜質(zhì)”則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或洗脫條件而回收下來。為了更有效地利用pull-down技術(shù)，可以將待純化的蛋白以融合蛋白地形式表達(dá)，即將“誘餌”蛋白與一種易于純化的配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。從此GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到極大的推廣。GST融合蛋白在經(jīng)過固定有GST(glutathione)的色譜柱時，就可以通過GST與GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)再有細(xì)胞抽提物過柱，就可得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的興趣蛋白誘餌蛋白獵物蛋白GST融合蛋白pull-down技術(shù)的應(yīng)用：鑒定與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)鑒定兩個已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用2.免疫共沉淀（Co-IP）免疫共沉淀技術(shù)（Co-Immunoprecipitation）是以抗原-抗體之間的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。實驗步驟及內(nèi)容構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4℃，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；取少量裂解液以備westernblot分析，剩余裂解液加1mg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4℃緩慢搖晃孵育過夜；取10mlproteinA

瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；將預(yù)處理過的10mlproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4℃緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶聯(lián)（proteinA可特異結(jié)合免疫球蛋白的Fc段）；免疫沉淀反應(yīng)后，在4℃以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15ml的2×sds上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；SDS,westernblotting或質(zhì)譜儀分析。IP-immunoprecipitationIB-immunoblotting免疫共沉淀的優(yōu)點為：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。免疫共沉需注意的問題：細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑。選擇合適的抗體，有些抗體不一定適合做IP。使用對照抗體。3.酵母雙雜交

（Yeasttwo-hybridsystem）基本原理—真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個可獨立存在的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain,BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptionalactivationdomain，AD）。這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則可特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。基于這個原理，人們將兩個待測蛋白分別與這兩個結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個待測蛋白間能發(fā)生相互作用就會使AD與BD形成完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報告基因表達(dá)。通過對報告基因表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)由三個部分組成：與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；AD融合的蛋白表達(dá)載體，其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白（prey）；帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因，有利于雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。篩選文庫4.Co-IP—質(zhì)譜免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜（Mass-spectrometric）技術(shù)：在生理條件下，用靶蛋白相應(yīng)抗體沉淀靶蛋白，SDS電泳分離，切下相應(yīng)條帶做質(zhì)譜分析，得到相應(yīng)條帶蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。1235467891011121375kD50kD37kD20kD25kD100kD質(zhì)譜分析，得到一級結(jié)構(gòu)Co-IP5.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片是指固定于支持介質(zhì)上的蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。又稱蛋白質(zhì)微陣列(Proteinmicroarray)。是在一個基因芯片大小的載體上，按使用目的的不同，點布相同或不同種類的蛋白質(zhì)，然后再用標(biāo)記了熒光染料的蛋白質(zhì)結(jié)合，掃描儀上讀出熒光強(qiáng)弱，計算機(jī)分析出樣本結(jié)果。基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光抗菌素體的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測定芯片上各點的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測定各種蛋白質(zhì)功能的目的。實驗步驟固體芯片的構(gòu)建：常用的材質(zhì)有玻片、硅、云母及各種膜片等。探針的制備生物分子反應(yīng)：使用時將待檢的含有蛋白質(zhì)的標(biāo)本如尿液、血清、精液、