第二章細胞生物學研究方法第三章細胞生物學研究方法_1本章內容提要

第一節顯微技術一、光學顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術第二節細胞組分的分析方法第三節細胞培養與細胞雜交第三章細胞生物學研究方法_1

第一節顯微技術光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。第三章細胞生物學研究方法_1—、光學顯微鏡（一）普通光學顯微鏡1.構成：?①照明系統?②光學放大系統?③機械裝置2.原理：經物鏡形成倒立實像，經目鏡進一步放大成像。第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_13、最高分辨率：0.2um，由光的波動性質決定（最小波390nm）R=0.61λN．sinα/24、三個條件：1必須用聚光透鏡將一束亮光聚焦到樣品上2需制備樣品，使之透光3設置一套合適的透鏡組第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1（二）熒光顯微鏡?

特點：光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡?

有兩個特殊的濾光片?

照明方式通常為落射式第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1用于觀察能激發出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen第三章細胞生物學研究方法_1（三）激光共聚焦掃描顯微境（LCSM）?

用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描?

能顯示細胞樣品的立體結構。?

分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。?

用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡第三章細胞生物學研究方法_1

原理以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50－120KV)的平方根成反比?

由電子照明系統、電磁透鏡成像系統、真空系統、記錄系統、電源系統等5部分構成?

分辨力0.2nm，放大倍數可達百萬倍。?

用于觀察超微結構，即小于0.2μm、光學顯微鏡下無法看清的結構，又稱亞顯微結構。第三章細胞生物學研究方法_1

不同光線的波長

名稱可見光紫外光X射線α射線

電子束0.1Kv10Kv波長（nm）390~76013~3900.05~130.005~10.1230.0122第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_12、制樣技術?1）超薄切片?

電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機制作?

通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_12）負染技術?

用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方沒有染料沉積，從而出現負染效果，分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedActin第三章細胞生物學研究方法_13）冰凍蝕刻?

亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中（－196℃）然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結構。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。AYeastCell第三章細胞生物學研究方法_1（二）掃描電子顯微鏡第三章細胞生物學研究方法_1工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。掃描電鏡主要用來觀察樣品表面的形貌特征，為避免干燥過程中樣品因表面張力的作用發生變形，常采用二氧化碳臨界點干燥法。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1（三）掃描隧道顯微鏡（STM）?

原理：根據隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV－2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態。?

分辨率：橫向為0.1－0.2nm，縱向可達0.001nm。?

用途：三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察。第三章細胞生物學研究方法_1掃描隧道顯微鏡原理第三章細胞生物學研究方法_1思考：比較電子顯微鏡和光學顯微鏡的優點及缺點。對下列目標你用什么方法做最佳觀察：一個活的皮膚細胞、一個酵母線粒體、一個細菌、一條微管能否用透射式電子顯微鏡反映樣品的表面立體形貌，而用掃描式電鏡反映樣品內部的狀況。第三章細胞生物學研究方法_1三、顯微操作技術?

在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內移動的機械裝置。?

顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。–

細胞核移植技術已有幾十年的歷史，Gordon等人（1962）對非洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學者童第周等上個世紀70年代在魚類細胞核移植方面進行了許多工作，并取得了豐碩成果。第三章細胞生物學研究方法_1顯微操作儀第三章細胞生物學研究方法_1

第二節細胞組分的分析方法一、離心技術?

是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段?

轉速為10－25kr/min的離心機稱為高速離心機?

轉速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機?

目前超速離心機的最高轉速可達100kr/min，離心力超過500Kg。第三章細胞生物學研究方法_1（一）差速離心?

特點：–

介質密度均一；–

速度由低向高，逐級離心。?

用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。?

沉降順序：核—線粒體—溶酶體與過氧化物酶體—內質網與高基體—核蛋白體。?

可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1（二）密度梯度離心?

用介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。?

類型：速度沉降、等密度沉降。?

常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。?

分離活細胞的介質要求：–1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；–2）PH中性或易調為中性；–3）濃度大時滲透壓不大；–4）對細胞無毒。第三章細胞生物學研究方法_1四、免疫細胞化學?根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術。常用的標記物有熒光素和酶。?

免疫熒光法：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。?

酶標免疫法：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發生反應后形成不透明沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。第三章細胞生物學研究方法_1五、放射自顯影術?

用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。?

原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內，經過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經放射性曝光，使乳膠感光。?

一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3HUDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。–14C半衰期為5730年，3H為12.5年。第三章細胞生物學研究方法_1

二、流式細胞術?

用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。?

原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計。第三章細胞生物學研究方法_1第三章細胞生物學研究方法_1

三、細胞電泳?

原理：在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發生泳動。?

各種細胞或處于不同生理狀態的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同。?

用途：檢測細胞生理狀態和病理狀態、分離不同種類的細胞，如分離哺乳動物的XY精子。第三章細胞生物學研究方法_1第三節細胞培養與細胞雜交一、細胞培養（一）動物細胞培養?

群體培養：將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層?

克隆培養：培養高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。–

轉鼓培養法：為制取細胞產品而設計，大容量旋轉培養，使培養的細胞始終處于懸浮狀態之中。第三章細胞生物學研究方法_1原代培養：即：培養直接來自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養瓶轉移到另外一個培養瓶稱為傳代或傳代培養?

細胞株：從原代培養細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。?

細胞系：從腫瘤組織培養建立的細胞群或培養過程中發生突變或轉化的細胞，可無限繁殖。?

克隆：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。第三章細胞生物學研究方法_1（二）植物細胞培養1.外植體培養：誘發產生愈傷組織。用于研究植物的生長發育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產物。2.懸浮細胞培養：適合于進行產業化大規模細胞培養，制取植物代謝產物。3.原生質體培養：培養脫壁后的細胞，特點：–①比較容易攝取外來的遺傳物質，如DNA；–②便于進行細胞融合，形成雜交細胞；–③適宜條件下可產生細胞壁，經誘導分化成完整植株。4.單倍體培養：通過花藥或花粉培養可獲得單倍體植株。第三章細胞生物學研究方法_1PlantCellCultureAnimalCellCulture第三章細胞生物學研究方法_1二、細胞融合?

通過培養和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合或細胞雜交。?

同核體：相同基因型的細胞融合而成。?

異核體：不同基因型的細胞融合而成。?

自發融合：同種細胞在培養過程中自發合并的現象。?

誘發融合：異種間的細胞必須經誘導劑處理才能融合