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12法RapiddetectionofliveEscherichiacoliinorganicfertilizerbyPMA-qPCRmethodI本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定本文件起草單位：天津市農業科學院畜牧獸醫研究所、農業農村部環境保護科研監測1有機肥中活性大腸桿菌快速測定PMA-qPCR法本文件規定了有機肥中活性大腸桿菌PMA-GB/T6682分析實驗室用水規格和GB/T19438.1禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢在一定條件下可以引起人和多種動物發生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染的致病菌。4縮略語PMA：疊氮溴化丙錠（propidiummonoazPCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreactqPCR：實時熒光定量PCR（quantitativeSYBRGreenI：核酸凝膠染料(SYROX:參比染料（ROXreference2可以進入死亡細菌受損細胞膜，并永久修飾其DNA，阻斷DNA的PCR擴增。在強光照射下，游離在溶液中未與核酸交聯的剩余PMA可與水分子反應，生成沒有活性的羥胺。羥胺不會對后續從活細菌提取的DNA）：6.1.7SYBRPremixExTaq染料法實時熒光定6.1.8qPCR標準品：含有目的基因的克隆質表1大腸桿菌uidA基因qPCR擴增引物5’-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3’5’-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’超凈工作臺、冰箱（0℃~4℃)、分析天平（精度0.01g）、恒溫震蕩培養箱、LED光解儀（波長465nm～475nm、溫度低于37℃)、低溫離心機（最大離心力≥器、核酸自動提取儀、qPCR儀、超微量將采集的樣品混勻，用四分法將樣品縮分至53應將樣品放入0℃~4℃冰箱保存，放置時間不應超過24h。9檢測步驟9.1樣品制備將樣品進一步縮分后研磨至全部通過?1mm尼龍篩，混勻。無菌操作下稱取樣品10.0g，加入到帶玻取1mL上清液至離心管中，加入0.2mLPMA工作液，PMA終濃度約為8可選用等效的商品化核酸提取試劑盒，或選用核酸自動提取儀及配套試劑，參考附9.5標準曲線ccopies=×NA…………（1）NA——阿伏伽德羅常數，取6.02×1023。45A.1試劑盒洗液去除雜質，最終由洗脫液將核酸從磁珠上洗脫下來。試劑盒內包含的試劑規格和數量見表A.11瓶1瓶2瓶2瓶1瓶A.2耗材A.3儀器及設備A.4操作步驟A.4.1試劑添加A.4.2加樣取200μL樣品上清液，加入到萃取樣品盤的1#列/6A.4.3啟動推入底部。關閉自動核酸萃取儀進樣門，按下“開始”按鈕。萃取反應將在1小時內7[10]於穎.PMA-qPCR定量檢測畜禽肉類中食源性[11]蓋冬雪,任洪林,盧士英,等.乳品中大腸桿

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