熒光光譜熒光簡介常用熒光光譜及特征熒光強度影響因素熒光光譜的光譜參數用途熒光：某些物質受到照射后發出能量較低的光，一旦光照停止，光線也立即消失，稱為熒光。入射光和發射光頻率之差稱為斯托克頻移。滿足上述條件即為熒光。因此熒光范圍比較寬，從X射線到紅外光譜區仍然是熒光。其他的能量如（化學反應、加熱、生物代謝等）也會有熒光。生活中很多現象都與熒光相關。如：鈔票防偽，日光燈管，螢火蟲發光。1.熒光介紹1）熒光產生及其物理機制S2S1S0T1吸收發射熒光發射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫a)光吸收：熒光物質從基態躍遷到激發態，過程約10-15s。此時，熒光分子處于激發態。b)內轉換：處于電子激發態的分子由于內部的作用，以無輻射躍遷過渡到低的能級。c)外轉換：處于電子激發態的分子由于和溶劑以及其他分子的作用，以及能量轉移，過渡到低的能級d)熒光發射：如果不以內轉換的方式回到基態，處于第一電子激發態最低振動能級的分子將以輻射的方式回到基態，平均壽命約為10ns左右。e)系間轉換：不同多重態,有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。如電子自旋改變，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。f）振動馳豫：高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發生振動弛豫的時間10-12s。2.常用熒光光譜1）熒光的激發光譜，發射譜激發譜：固定測量波長(選最大發射波長),化合物發射的熒光強度與激發光波長的關系曲線。熒光光譜有瞬態熒光光譜和穩態熒光光譜兩類。通常熒光光譜指的是穩態熒光光譜。熒光的發射譜：固定激發波長，發射強度與發射波長的關系。

熒光光譜特點靈敏度高：比紫外-可見分光光度法靈敏度高2-3個數量級，比原子吸收分光光度法高103～104倍，檢測限可達ng／mL線性范圍寬:0.005mg/L-50mg/L分析成本低設備簡單，操作簡單快速，計算機進行儀器控制和數據處理提供激發光譜、發射光譜等許多信息2).熒光光譜的特征a.Stokes位移激發光譜與發射光譜之間的波長差值。發射光譜的波長比激發光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

b.發射光譜的形狀與激發波長無關電子躍遷到不同激發態能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產生不同吸收帶，但均回到第一激發單重態的最低振動能級再躍遷回到基態，產生波長一定的熒光(如

‘2)。

c.

鏡像規則通常熒光發射光譜與它的吸收光譜（與激發光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。3.熒光光譜儀及使用技術光源

激發單色器樣品池檢測器發射單色器檢測器

熒光是散射譜，所以一般在垂直入射方向接收。背景是沒有入射光，是“暗背景”，因此靈敏度更高。1）熒光光譜儀9光譜測試開機

電源——燈源2.發射譜

根據吸收譜中感興趣的峰確定激發波長，選擇合適的發射譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行發射譜的掃描。3.激發譜

根據發射譜中感興趣的峰確定發射波長，選擇合適的激發譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行激發譜的掃描。104.發射譜

根據激發譜中感興趣的峰確定激發波長，選擇合適的發射譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行發射譜的掃描。5.重復3、4步循環掃描得到理想的光譜圖。7.關機

光源——電源6.保存數據11光譜數據處理測得的數據結果需要應用origin軟件進行數據處理和作圖分析。為了消除儀器本身的影響，測得的光譜曲線需要應用校正曲線進行校正。校正過的光譜數據可以應用色坐標軟件進行顏色分析。

熒光隨著濃度增高，強度反而減小，稱為濃度猝滅。原因可能是：a濃度增加，分子碰撞機會增加，增加了非輻射損耗。b溶液中其他雜質吸收發出的熒光。（內濾光）c吸收譜和發射譜重疊，熒光又被吸收。（自吸收）d儀器原因3）.熒光光譜的環境效應5.熒光實驗方法及其用途熒光猝滅熒光偏振熒光能量共振轉移時間分辨熒光光譜熒光標記

熒光猝滅泛指任何可以減低樣品熒光強度的過程。狹義主要指那些由于熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用所引起的熒光強度降低的情況。原因：溶劑猝滅劑和熒光物質之間發生相互作用而引起熒光效率降低或激發態壽命縮短，導致強度降低。

1）.熒光猝滅

（1）熒光偏振現象及用途一旦用偏振光照射，從許多樣品出射的光也是偏振的。當樣品各個方向出射的偏振光是不相同的，可以說樣品顯示出偏振的特性。研究偏振可以提供分子及周圍環境更多的信息：

偏振光照射到熒光分子上，分子對光的吸收和發射過程與分子框架相對偏振光的偏振方向相關。熒光偏振可以用來測量蛋白質的變形，蛋白質的結合以及蛋白質的內部動力學。2）熒光偏振3）.熒光能量共振轉移4).時間分辨光譜：輸入脈沖，然后進行對接收的信號進行相應分析。時間分辨壽命；時間分辨各向異性。

熒光各向異性可以采用穩態測量，也可以用瞬態方法進行測量。穩態測量是得到的是一個平均值，雖然容易解釋，但需要做很多假設。瞬態測量是測量脈沖激發后的時間相關各向異性。可以直接從實驗數據中觀察得到并進行解釋。各向異性與樣品尺寸、形狀以及標記分子的柔性相關，需要從各種分子模型進行計算擬合。各向異性衰減可以從TD或FD方法得到。目前還是采用時間分辨進行測量。熒光壽命當某種物質被一束激光激發后,該物質的分子吸收能量后從基態躍遷到某一激發態上,再以輻射躍遷的形式發出熒光回到基態.當激發停止后,分子的熒光強度降到激發時最大強度的1/e所需的時間稱