第十三章

RNA的生物合成（轉錄）

transcription轉錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉錄RNADNA

參與轉錄的物質底物(substrate):

NTP(ATP、UTP、GTP、CTP)模板(template)

:DNA酶:依賴DNA的

RNA聚合酶,

簡稱RNA聚合酶

(RNApolymerase,RNA-pol)其他：蛋白質因子、Mg2+、Mn2+第一節RNA合成中的模板和酶一、轉錄模板1結構基因(structuralgene):

能轉錄出RNA(mRNA、rRNA和tRNA)的DNA區段。2不對稱轉錄(asymmetrictranscription):DNA的一些區段可以轉錄出RNA，另一些不能轉錄出RNA。在DNA雙鏈上，一股鏈可轉錄，另一股鏈不轉錄；轉錄區不總是在同一單鏈上。5’3’5’3’2.方框內的DNA區段為結構基因為模板鏈(templestrand)

按堿基配對規律指導轉錄生成RNA1.箭頭示轉錄產物及轉錄方向4.為編碼鏈(codingstrand)5’…GCAGTACATGTC…3’3’…cgtcatgtacag…5’DNA5’…GCAGUACAUGUC…3’mRNAN…AlaValHisVal…C多肽鏈轉錄翻譯編碼鏈模板鏈*編碼鏈又稱為有意義鏈，模板鏈又稱為反義鏈

RNA聚合酶(DNAdependentRNApolymerase,RNApol)

,全稱依賴DNA的RNA聚合酶(DDRP),也稱轉錄酶（transcriptase)

。原核生物（E.Coli）RNApol

由α2ββ′σ

共5個亞基組成。α

2ββ′核心酶(coreenzyme)二、RNA聚合酶α2ββ′

σ全酶(holoenzyme)σ亞基+σ全酶(holoenzyme)

核心酶(coreenzyme)

（一）原核生物的RNA聚合酶β

聚合酶功能σ辨認轉錄起始點β′結合DNA模板（開鏈）大腸桿菌RNA聚合酶亞基的功能α

決定哪些基因被轉錄類型主要功能被利福平結合而抑制ααββ’TTGACATATAAT-35原核生物的RNA聚合酶及其在轉錄起始區的結合σ-10σ70(典型)σ32（應激）Heatshockprotein(Hsp)熱激蛋白（二）真核生物的RNA聚合酶真核生物RNApol的種類與功能種類轉錄產物對鵝膏蕈堿的敏感性

RNApolⅠ

RNApolⅡ

RNApol

Ⅲ45S是5.8S、18S和28SrRNA的前體hnRNA是mRNA的前體45SrRNA

不敏感hnRNA

極敏感tRNA、5S-rRNA中度敏感和snRNA

小分子核內核糖核酸(smallnuclearRNA，snRNA)

真核生物的RNA聚合酶亞基的功能50kD中亞基1α亞基小亞基Ⅰ(10)Ⅱ(7)

Ⅲ(11)

σ亞基(識別起始點)類型數目/每個酶對應于原核功能＞100kD大亞基2β和β′亞基(催化)★3種pol

的大亞基C末端aa序列均為(YSPTSPS)n;★

n=20-60,與種屬有關,稱羧基末端結構域(CTD);★含帶羥基的Y(酪)\S(絲)\T(蘇),可被磷酸化;★

polⅡ的磷酸化在從轉錄起始過渡到延長時重要。PS1S2S3啟動子OPromoter調控序列結構基因

操縱子

結合RNA聚合酶表達功能蛋白?I三、RNA聚合酶與模板的辨認結合操縱子（operon）:

原核生物的轉錄單位RNA聚合酶保護法RNA聚合酶保護區結構基因終止點-10轉錄開始+1-35模板與酶的辨認結合TTGACATATAAT（Pribnowbox）RNApol辨認結合區轉錄起始區共有序列第二節RNA生物合成(轉錄)過程起始

(initiation)

延長

(elongation)

終止

(termination)（一）原核生物的轉錄起始σ亞基辨認-35區RNApol

全酶移向-10區合成第一個磷酸二酯鍵5’-pppGpN-OH-3’轉錄起始復合物RNApol(α2ββ′σ)—DNA—pppGpN-OHσ亞基脫落(進入延長階段)（結合松弛）（結合較緊密）轉錄起始不需引物！pppG-OH

+pppN-OHγβαRNApol5′-pppGpN-OH-3′+PPi1.

亞基脫落，RNA-pol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n

+

NTP

(NMP)n+1+PPi（二）轉錄延長轉錄空泡(酶-DNA-RNA形成的轉錄復合物）RNA穩定性：GC>AT>AUtranscriptionbubble

RNApol（核心酶）DNA原核生物轉錄延長與蛋白質合成同 時進行

多個轉錄同時進行原核生物轉錄的特點：多聚核糖體(polysome)

（三）轉錄終止1.依賴Rho（ρ）因子的轉錄終止2.非依賴ρ因子的轉錄終止ρ因子1.識別結合富含C的RNA鏈功能2.ATPase活性3.解螺旋酶活性ρ因子+ATP5′3′Polymerase富含C1.依賴Rho（ρ）因子的轉錄終止RNApol5′3′RNApol失活ρ因子解螺旋，使RNA脫落RNA轉錄后，形成特殊的結構，以終止轉錄。2.非依賴ρ因子的轉錄終止特點：1.RNA單鏈內部接近終止區域有富含G-C配對區，形成穩定的二級結構。2.在發夾結構的下游有polyU結構。莖環（stemloop）或發夾（hairpin）結構UUGCAGCCUGAGAAAUCAGGCUGAUGG…5′3′…5′3′自發形成發夾結構（E.coli

rpl-L3’末端）第1個莖環AUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUU5′3′UUUU……5′3′自發形成莖環結構第2個莖環UUUU………..5′3′1.莖環結構改變RNApol的結構，使其失活2.莖環結構的形成使轉錄復合物趨于解體，polyU加速這一過程。GpN結構基因RNApol識別結合生成起始復合物轉錄延長轉錄終止啟動子終止點pppGpppG原核生物的轉錄過程σ二、真核生物的轉錄轉錄起始點上游-25bp區段多數有共同的TATA序列，稱為Hogness盒或TATA盒。不同物種、不同細胞、不同的基因，可以有不同的上游DNA序列，但都可統稱為順式作用元件(cis-actingelement)。（一）轉錄起始1.轉錄起始點的上游序列(upstreamsquences)與基因表達調控有關的DNA非編碼序列，統稱為順式作用元件。真正轉錄終止點GCGC-CAAT-TATA..ATGAATAAA修飾點外顯子內含子翻譯起始轉錄起始TATA盒(Hognessbox)CAAT盒GC盒增強子切離加尾真核生物RNApolⅡ轉錄的基因翻譯終止能直接或間接辨認、結合順式作用元件，從而調節基因表達的一類蛋白質因子。反式作用因子中，直接或間接結合RNA聚合酶的蛋白質因子。2.反式作用因子(trans-actingfactor)轉錄因子(transcriptionalfactor,TF)參與RNA-polⅡ轉錄的TFⅡ轉錄因子功能TFⅡA穩定TFⅡD-DNA復合物TFⅡB促進polⅡ結合TFⅡDTBP結合TATA盒TAF輔助TBP-DNA結合TFⅡEATPaseTFⅡF解螺旋酶TFⅡH蛋白激酶活性,使CTD磷酸化TAF：TBPassociatedfactorsTBP輔因子TBP：TATAbindingproteinTATA結合蛋白3.

轉錄起始前復合物(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結合，而需依靠眾多的轉錄因子。ⅡAⅡB由RNA-Pol

Ⅱ催化轉錄的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復合物TATAPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化ⅡAⅡBTBPTAFTATA拼板理論(piecingtheory)一個真核生物基因的轉錄需要3至5個轉錄因子。轉錄因子之間不同方案組合，生成有活性、專一性的復合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結合、轉錄相應的基因。

按不同組合，人類約３.５萬個基因，估計需轉錄因子３００余個即可。（二）轉錄延長*polⅡ大亞基CTD被TFⅡH磷酸化才能離開起動子區域并進入延長階段。*真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但沒有轉錄與翻譯同步的現象。*

RNA-pol前移處處都遇上核小體。

*轉錄延長過程中隨RNApol前移，可以觀察到核小體移位或解聚現象。轉錄延長中的核小體移位和解聚RNA-Pol核小體轉錄方向移位RNA-PolRNA-Pol解聚及彎曲（三）真核生物的轉錄終止AAUAAAGUGUGUGAATAAAGTGTGT3′processing（核酸內切酶）—AAUAAA—Poly(A)NucleaseHelicasehnRNA5’Release轉錄終止修飾點pausepolII（一）真核生物mRNA的剪接

1.hnRNA

(heterogeneousnuclearRNA)富含Ｕ不均一核RNA，核內未被剪接的有內含子的mRNA前體。2.

snRNA

(smallnuclearRNA)種類：U1，U2，U3，U4，U5，U6等。幾個重要概念第三節RNA的轉錄后加工一、真核生物新生mRNA的剪接和修飾核內小RNAsnRNP（小分子核糖核蛋白體）

(RNA剪接的場所)

核內蛋白質snRNA4.斷裂基因(splitgene)真核生物的結構基因中，外顯子被內含子間隔開，但連續鑲嵌，為一個連續完整的蛋白質編碼。這種基因稱為斷裂基因。3.外顯子(exon)和內含子(intron)真核生物結構基因中的編碼序列，稱為外顯子，非編碼序列稱為內含子。SPreBCA成熟的mRNA5′——3′SPreBCCAhnRNA胰島素基因斷裂基因的概念內含子的分類

根據基因的類型和剪接的方式，通常把內含子分為4類。I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發現于線粒體、葉綠體，轉錄產物是mRNA；III：是常見的形成套索結構后剪接，大多數mRNA基因有此類內含子；IV：是tRNA基因及其初級轉錄產物中的內含子，剪接過程需酶及ATP。內含子的功能，兩種觀點：1.內含子是在進化中出現和消失的，是進化過程中的遺跡，無實質性意義。2.內含子影響剪切效率及剪切位置，在基因表達中有調控功能。真核生物mRNA的剪接過程剪接體(splicesome)識別結合hnRNA內含子5’及3’區域2.形成套索RNA(lariatRNA)，外顯子靠近3.兩步轉酯反應，切去內含子，連接外顯子（剪接體是snRNP與hnRNA結合）外顯子內含子DNAmRNA轉錄形成套索RNA，外顯子靠近剪接體去除套索RNA，外顯子連接成熟mRNACAUUCAUAUGAUGU外顯子1外顯子2GUAAGUAUACUACAAG5’3’內含子分支點U1U2剪接體形成套索RNA外顯子靠近GpUE1E2UpAI1U-OHE1GpUE2pAI1pG-OH第一步轉酯第二步轉酯intronexon1exon2UpUE1G-OHE2pAI1ppG\pppG（二）mRNA編輯☆mRNAediting是指轉錄后的RNA在編碼區發生堿基的加入、刪除或轉換等現象。☆使翻譯生成的蛋白質的氨基酸組成，不同于基因序列中的編碼信息。☆使得一個基因序列有可能產生幾種不同的蛋白質，這可能是生物在長期進化過程中形成的、更經濟有效地擴展原有遺傳信息的機制。☆基因的編碼序列經過轉錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differentialRNAprocessing)。圖13-38

分化加工(differentialRNAprocessing)513kDApoB100ApoB485′GpppG…鳥苷酸轉移酶5′…m7GpppG…RNA甲基轉移酶磷酸酶PPi5′pG…5′pppG…RNAGTPSAMSAHhnRNA+nATPpolyA聚合酶Mg2+RNA-(A)n+nPPi加帽加尾Pi在hnRNA

5’端加上m7GpppG--在hnRNA

3’端加上polyA（三）mRNA首、尾的修飾加帽加尾的意義：1.蛋白質翻譯起始所需2.mRNA穩定性所需3.polyA尾與mRNA轉位、作為翻譯模板及其穩定有關G二、tRNA的轉錄后加工DHU—loopT

looptRNA的初級轉錄產物RNApolIIIIntronExonAnticodonloop二氫尿嘧啶(反密碼子環)加工

tRNA的初級產物成熟tRNA內切酶RNaseP連接酶轉移酶氨基酸臂CCA—OH的生成：核苷酸轉移酶催化堿基修飾（2）還原反應如：U

DHU（3）核苷內的轉位反應如：U

ψ（4）脫氨反應如：A

I（1）（1）（3）（2）（4）如：A

mA

（1）甲基化

G

mG

三、rRNA的轉錄后加工真核生物rRNA的基因屬于豐富基因族的DNA序列，也即高度重復的串聯基因(tandemgene)，或稱為高度重復序列DNA。45srDNA45srRNA18s，5.8s，28s

rRNARNApolI45srDNA間隔區(spacer)內含子外顯子5srDNA5srRNARNApolIII轉錄(RNApolI)45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA內含子內含子28S5.8S18S最早發現四膜蟲rRNA的剪接不需要任何蛋白質參與即可發生，說明rRNA本身就有酶的催化作用。概念：具有酶促活性(催化功能)的RNA。四、核酶(ribozyme)核酶發現的意義：1.對傳統酶學提出挑戰2.生物進化中的意義3.潛在的基因治療的有力工具切割點槌頭型(hammerheadstructure)核酶的結構GU

GNNNNNNNNNN

3'5'

N

C

A

A

NNNA

NNNA

C

N

A

N

C

U

G1.至少有3個莖2.1—3個環3.至少有13個一致性序列切割點切割點XXXNXXX5’