GAIAxxx—xxxx血清中米酵菌酸的測定超高效液相色譜串聯質譜法本標準規定了血清中米酵菌酸的超高效液相色譜串聯質譜定性定量檢測方法。標準適用于血清中米酵菌酸的定性、定量分析。其他可疑樣品中米酵菌酸的定性、定量分析可參照使用。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T8170數值修約規則與極限數值的表示和判定WS/T679突發中毒事件衛生應急處置技術規范總則3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理樣品用0.1%氨水甲醇－乙腈溶液（80∶20，v/v）提取，采用超高效液相色譜串聯質譜法檢測，以保留時間、質譜特征碎片離子峰和相對豐度比作為定性判斷依據，以峰面積為定量依據，采用外標法進行定量分析。5試劑與材料5.1試劑5.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。5.1.2甲醇（CH3OH）：色譜純。5.1.3甲酸（CH2O2）：色譜純。5.1.4氨水（NH4OH）：色譜純。5.2試劑配制搖勻。5.2.20.05%甲酸水溶液：取5mL甲酸，用水定容至1000mL，搖勻。3GAIAxxx—xxxx5.3標準溶液配置5.3.1米酵菌酸標準儲備溶液（10.0mg/L）：根據米酵菌酸標準物質的純度，稱取適量標準物質固體，用甲醇配制成10.0mg/L米酵菌酸標準物質溶液，-20℃避光保存，有效期6個月。或采用市售有證標準溶液配置。5.3.2米酵菌酸標準中間溶液（200μg/L準確吸取米酵菌酸中間溶液（5.3.1）200μL于10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為200μg/L的標準中間溶液，-20℃避光保存。5.3.3米酵菌酸標準使用溶液：準確吸取米酵菌酸標準中間溶液（5.3.2），用初始流動相逐步稀釋成濃度為0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L的系列標準工作溶液，臨用現配。5.4材料5.4.1具塞塑料離心管：2mL。5.4.2吸管：5mL。5.4.3微孔濾膜（有機相）：0.22μm6儀器和設備6.1超高效液相色譜質譜聯用儀：配電噴霧離子源（ESI）和三重四極桿質量分析器。6.2離心機:轉速不低于10000r/min。6.3渦旋震蕩器。6.4精密移液器。6.5生物安全柜。7試樣的采集、保存和運輸試樣的采集、保存和運輸應符合WS/T679-2020中的第8章要求。8分析步驟8.1個人防護在處理樣本時，應嚴格遵從對潛在生物傳染性樣本處理的相關規定，使用時遵循生物安全規則，于生物安全柜中對樣本進行實驗操作，并根據規定對廢物進行處理，做好相應個人防護。8.2提取準確移取血清樣品0.2mL于2mL塑料離心管中，加入1mL0.1%氨水甲醇－乙腈溶液（5.2.1渦旋2min，10000r/min離心5min，取上清液于2mL塑料離心管加入0.5mL正己烷渦旋混合，靜置2min后，取甲醇－乙腈層過0.22μm濾膜后上機。8.3儀器檢測8.3.1液相色譜參考條件a）色譜柱：AcquityBEHC18色譜柱（2.1×50mm，1.7μm），或相當者。4GAIAxxx—xxxxb）流動相：A為0.05%（v/v）甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫條件見表1。表1液相色譜梯度洗脫條件時間（min）A（%）B（%）0.0703070303.06.0907.05957.170309.07030c）流速：0.3mL/min。d）柱溫：40℃。e）進樣量：5μL。8.3.2質譜儀參考條件a）離子源：電噴霧離子源（ESI）。b）毛細管電壓：-2.5kv；去溶劑溫度：500℃。c）掃描方式：負離子掃描。d）檢測方式：多反應檢測（MRM）。e）霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣由氮氣發生器產生或使用高純氮氣、碰撞氣均為高純氬氣；使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求。f）錐孔電壓、碰撞能量等電壓值優化至最優靈敏度。g）定性離子對、定量離子對，錐孔電壓及碰撞能量見表2。表2米酵菌酸的質譜參數化合物保留時間(min)離子對(m/z)錐孔電壓(V)碰撞能量(eV)米酵菌酸4.37定量：485.2>441.2-22-12定性：485.4>397.3-22-188.3.3標準曲線的制作精確吸取5μL的米酵菌酸系列標準工作溶液（5.3.3），由低濃度到高濃度依次注入超高效液相色譜-質譜聯用儀中進行測定。以米酵菌酸定量用子離子的質量色譜圖峰面積為縱坐標，相對應的標準工作溶液濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。標準溶液的液相色譜圖參見附錄A圖A。8.3.4定性測定在相同實驗條件下進行樣品測定時，被測試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，相對誤差應在±2.5%之內，并且在扣除背景后的樣品質譜圖中，所選擇的離子均出現，而且所選擇的離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致（相對豐度＞50%，允許±20%偏差；相對豐度20%～50%，允許±25%偏差；相對豐度10%～20%，允許±30%偏差；相對豐度≤10%，允許±50%偏差則可判斷樣品中存在米酵菌酸。5GAIAxxx—xxxx8.3.5定量測定本標準采用外標-標準曲線法定量測定，定量用標準溶液采用同種基質配置，且所測樣品中米酵菌酸的相應值應在儀器的線性范圍內，如果試樣待測液中被測物質的響應值超出儀器檢測的線性范圍，可適當稀釋后測定。8.4空白試驗除不加試樣外，均按照上述測定步驟進行。9結果計算和表述試樣中米酵菌酸的含量C按式（1）計算。式中：C──待測組分含量(μg/L）；C0──由標準曲線求得樣液中被測組分濃度(μg/L）；V──樣品定容體積（mL）；V0──樣品取樣體積（mL）；注：計算結果需扣除空白值。測定結果用兩次平行測定的算術平均值表示，計算結果保留三位有效數字。10方法的靈敏度、精密度和準確度10.1靈敏度本方法檢出限為1.0μg/L，