第五章轉錄轉錄（transcription）是以DNA為模板，在依賴DNA的RNA聚合酶的催化下，以4種rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA的過程。轉錄是DNA將遺傳信息傳遞給蛋白質的中心環節。在有些RNA病毒中，RNA也可以指導RNA的合成。基因轉錄：DNAmRNAThefunctionofpolymeraseistocopyonestrandofduplexDNAintoRNA

1957年Crick提出了中心法測(centraldogma)

DNA→RNA→蛋白質

1970Crick又作了部分修改：

DNARNA蛋白質轉錄過程中，DNA雙鏈中的一條鏈為模板鏈（template/antisensestrand），而另一條鏈為編碼鏈（coding/sensestrand）。轉錄起始于RNA聚合酶和啟動子(promoter)結合之后，轉錄起始的第一個堿基稱為轉錄起始點(startpoint)

。在RNA聚合酶的作用下合成RNA，至終止子(terminator)終止。由啟動子到終止子之間的序列稱為轉錄單位(transcriptionunit)。轉錄起始點前面的序列稱為上游(upstream)，后面的序列稱為下游(downstream)。AtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA，startingatthepromoterandendingattheterminator

RNA合成和DNA復制的區別（1）轉錄時只有一條DNA鏈為模板，而復制時兩條鏈都可作為模板；（2）DNA-RNA雜合雙鏈不穩定，RNA合成后釋放，而DNA復制叉形成后一直打開，新鏈和母鏈成雙鏈；（3）RNA合成不需引物，而DNA復制需引物；（4)轉錄的底物是rNTP，復制的底物是dNTP；（5）聚合酶系不同。第一節轉錄酶和轉錄因子1960年Weiss等發現RNA聚合酶（RNAPol）。其特點是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTP）為底物；（2）以DNA為模板；（3）按5′-3′方向合成；（4）無需引物的存在能單獨起始鏈的合成；（5）第一個引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在體內DNA雙鏈中僅一條鏈作為模板；（7）RNA的序列和模板是互補的。RNApol和DNApol有2點不同：（1）RNApol沒有任何校對功能；（2）能起始新的RNA鏈。一、原核生物的RNA聚合酶大部分原核生物的RNA聚合酶的結構十分相似，在聚合酶的表面形成一條約2.5nm的通道，是容納DNA分子的場所。細菌RNA聚合酶的大小約為9.5nm9.5nm16nm。1.大腸桿菌RNA聚合酶大腸桿菌RNA聚合酶由多亞基組成，全酶組裝過程為

2++’+

，分子量為480KDa左右。

亞基與全酶結合疏松，很容易與全酶分離。全酶可以起始RNA的合成，之后亞基從全酶解離下來。BacterialRNApolymerasehavefourtypesofsubunit;α,β,andβ’haveratherconstant

sizesindifferentbacterialspecies,butσvariesmorewidely.

亞基可能參與全酶的組裝及全酶識別啟動子。另外，亞基還參與RNA聚合酶與一些轉錄調控因子間的作用。亞基具有與底物（NTP及新生的RNA鏈）結合的能力。利福霉素可以阻斷轉錄的起始，鏈霉溶菌素可抑制延伸反應，二者均是通過與亞基的結合而發揮作用的。’亞基可能與模板結合。肝素可與’亞基結合而抑制轉錄，并且可以和’亞基競爭DNA的結合位點。

亞基和’亞基提供了RNA聚合酶的活性中心，其一級結構與真核生物RNA聚合酶大亞基有同源性。亞基的功能是幫助全酶識別啟動子并與之結合。亞基也可被看作一種輔助因子，因此又可稱為因子（Sigmafactor）。在轉錄過程中，RNA聚合酶需要與其他蛋白質輔助因子（轉錄因子）共同作用，才能保證轉錄的順利進行。如轉錄終止時的終止因子和抗終止因子。大腸桿菌RNA聚合酶多亞基的復雜結構主要是為酶提供了與多種因子相互作用的能力，從而可以識別多種啟動子。2.

因子RNA聚合酶要負責所有基因的轉錄，也就是說要識別所有轉錄單位的啟動子。因此，因子在RNA聚合酶識別啟動子的過程中起關鍵作用。因子的二級結構屬于螺旋，是通過識別啟動子上的某一序列來控制RNA聚合酶與啟動子的結合的。AmapoftheE.coliσ70factoridentifiesconservedregions.Regions2.1and2.2contactcorepolymerase,2.3isrequiredformelting,and2.4and4.2contactthe-10and-35promotorelements.TheN-terminalregionprevents2.4and4.2frombindingtoDNAintheabsenceofcoreenzyme.E.colisigmafactorsrecognizepromoterswithdifferentconsensussequences.(Numbersinthenameofafactorindicateitsmass)Aminoacidsinthe2.4α-helixofσ70contactspecificbasesinthenon-templatestrandofthe-10promotersequence.目前已發現了至少4種因子。在細菌受到外界環境的急劇影響時，會改變所表達的基因，產生因子更替的現象。如環境溫度升高時，大腸桿菌會開啟rpoH基因的表達，其產物32能識別熱激基因的啟動子，而正常狀態下表達的基因會關閉或表達水平下降。芽孢菌生活周期過程中生活方式的改變也是通過因子的更替完成的。RNApol

執行多種功能(1)識別DNA雙鏈上的啟動子；(2)使DNA變性，在啟動子處解旋成單鏈；及再旋酶活性。(3)通過閱讀啟動子序列，RNApol確定它自己的轉錄方向和模板鏈。(4)聚合NTP活性。(5)最后當它達到終止子時，通過識別終止子停止轉錄。二、真核生物的RNA聚合酶在真核生物細胞中，共有三類RNA聚合酶，即RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ。它們對鵝膏蕈堿（

-amanitine）的敏感性不同，在細胞核中的定位也有差異。YeastRNApolymerasehasgroovesthatcouldbebindingsitesfornucleicacids.ThepinkbeadsshowapossiblepathforDNAthatis~25?wideand5-10?deep.Thegreenbeadsshowanarrowerchannel,12-15?wideand~20?deep,thatcouldholdRNA.NTPuptakechannelisinthebackchannelsintoandoutoftheopencomplexDNAenteringchannel

B220～240Kda—與模板結合，與鏈的起始，延伸有關，相當于原核RNAPol的β′亞基C端含有羧基末端功能區 大亞基B140～150Kda—與DNA、底物和新生的RNA結合，相當于原核RNAPolβ

B44.5—酶的連接，相當于原核RNA的α亞基 RNAPolⅡ ABC27KDa磷酸化蛋白，

1類—三種RNAPol共有，如ABC25.5KDa與DNA結合有關

ABC23KDa B12.6

小亞基

2類—PolⅡ特有

B23 B14.5 B10 3類—在某些條件下可除去的亞基 B23 參與酶的基本結構

B16.5 細胞器的RNAPol—和噬菌體的RNA相似，因有單一固定的功能，分子量較小 表12-3真核生物聚合酶的成分及功能 RNA聚合酶Ⅰ位于核仁，活性所占比例最大，負責rRNA（5.8S、18S和28S）的轉錄。RNA聚合酶Ⅰ負責了大部分細胞RNA的轉錄。RNA聚合酶Ⅱ位于核質，活性所占比例僅次于RNA聚合酶Ⅰ，主要負責核內不均一RNA(heterogenousnuclearRNA,hnRNA/mRNA前體）的轉錄。RNA聚合酶Ⅲ也位于核質，活性所占比例最小，負責tRNA、5SRNA、Alu序列和其他小RNA的轉錄。真核生物的RNA聚合酶的分子量都很大，由8至14個亞基組成。經純化的RNA聚合酶具有以DNA為模板合成RNA的能力，但不能正確地選擇啟動子。目前尚不能完成RNA聚合酶的體外重建，無法確定哪些亞基是活性所必需的。第二節啟動子啟動子(promoter)是指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結合，形成起始轉錄復合物的區域。啟動子上還包括一些調節蛋白因子的結合位點。啟動子是控制轉錄起始的序列，并決定著某一基因的表達強度。與RNA聚合酶親和力高的啟動子，其起始頻率和效率均高。一、原核生物的啟動子在原核生物的基因組中，能夠被RNA聚合酶識別的最小DNA片段為12bp。研究啟動子特性的方法之一是比較不同啟動子的序列，從中發現一些同源性比較強的部分，又稱為保守序列。原核生物啟動子（promoter）的結構和特點

(1)典型結構,都含識別（R),結合（B)和起始

（I）位點;(2)序列保守;(3)位置和距離都比較恒定；

(4)直接和多聚酶相結合；

(5)常和操縱子相鄰；

(6)位于基因的5′端；

(7)決定轉錄的啟動和方向。

(8)特殊的啟動子的R,B序列不同。1.原核生物啟動子的結構

典型的原核生物的啟動子的結構為：－35區、16～19bp的間隔區、－10區和轉錄起始點，－10區到轉錄起始點的距離為7bp

轉錄起始點

轉錄起始點在多數情況下為嘌呤，常見的序列為CAT，A為轉錄起始點。轉錄起始點左右的堿基也可影響轉錄的起始。例如，＋1至＋30的轉錄區可以影響RNA聚合酶對啟動子的清除，從而影響啟動子的強度。

－10區在轉錄起始點的上游有一個6bp的保守序列，由Pribnow和Schaller（1975）發現，故也稱為Pribnow框盒（Pribnowbox）。幾乎在目前已知的所有啟動子中均存在。保守序列的中心位于轉錄起始點上游約－10bp處，這一保守序列又稱為－10序列。其一致序列為TATAAT，又稱Pribnow框、結合位點，在RNA聚合酶的作用下首先解鏈。

其功能是：

(1)RNApol緊密結合;(2)形成開放啟動復合體；

(3)使RNApol定向轉錄。

－35區又稱為Sextama框盒（Sextamabox）。

在轉錄起始點上游－35bp處，有另一個保守序列，稱為－35序列。其保守序列為TTGACA，RNA聚合酶的σ因子可以識別該位點，稱為識別位點，

RNA聚合酶首先與識別位點結合，然后與結合位點相互作用。

該區域是啟動子強弱的決定因素。其功能是:(1)為RNApol的識別位點。

σ亞基識別-35序列，為轉錄選擇模板(2)-35和-10序列的距離是穩定的，此與RNApol的結構有關。

－10區與－35區間的距離

－35區和－10區之間的距離在絕大多數原核生物啟動子為16到18bp。該區域的堿基序列并不重要，但該距離的長短是至關重要的。適宜的距離可以為RNA聚合酶提供合適的空間結構，便于轉錄的起始。2.啟動子功能的研究方法研究啟動子功能的主要方法是啟動子的突變。啟動子堿基序列發生變化，可以改變啟動子的強弱。目前所知，幾乎影響啟動子功能的所有點突變均發生在兩個保守區域內，即－10區和－35區。－

35區的功能是提供RNA聚合酶的識別信號，而－10區是使封閉復合物轉變為開放復合物。3.RNA聚合酶與啟動子的結合研究RNA聚合酶與DNA之間的識別以及結合常常采用足跡法（footprinting）。經測定，RNA聚合酶與啟動子結合的區域為－50至＋20，這段序列包括了結合及起始所需的序列。另一種研究啟動子的方法是采用堿基修飾的方法。

可先用堿基修飾試劑對DNA和RNA聚合酶的復合物進行修飾，未與RNA聚合酶結合的DNA，其相應的堿基被修飾。而結合了RNA聚合酶的堿基則不被修飾。這些分析方法可以確定與RNA聚合酶緊密結合的位點。有趣的是，在－10區上游的所有緊密結合位點均位于一條DNA鏈上。這可使RNA聚合酶從DNA的一個側面接近并識別啟動子并與之結合。OnefaceofthepromotercontainsthecontactpointsforRNA二、真核生物的啟動子

1.RNA聚合酶Ⅰ啟動子的結構

RNA聚合酶Ⅰ的啟動子主要由兩部分組成的(bipartite)：核心啟動子（corepromoter）位于－45至＋20的區域內，足以使轉錄起始。上游調控元件（upstreamcontrolelement）位于－180至－107，可提高轉錄起始效率。2.RNA聚合酶Ⅱ啟動子的結構RNA聚合酶Ⅱ主要負責編碼蛋白質和部分核內小rRNA（smallnuclearRNA，snRNA）的基因的轉錄，其啟動子結構最為復雜。RNA聚合酶Ⅱ單獨并不能起始轉錄，必須和其他的輔助因子共同作用形成轉錄起始復合物才能起始轉錄。RNA聚合酶Ⅱ的啟動子位于轉錄起始點的上游，由多個短的序列元件組成，主要有三個保守序列：（1）帽子位點，又稱轉錄起始位點，其堿基大多數為A，這與原核生物相似。（2）TATA框，位于－30處，又稱Hogness框。一致序列TATAA（T）AA（T）。有些TATA框的突變不影響轉錄的起始，但可以改變轉錄起始位點。說明TATA框具有定位轉錄起始點的功能。

（3）CAAT框，位于－75處，一致序列為GGC（T）CATCT。CAAT框內的突變對轉錄起始的影響很大，決定了啟動子起始轉錄的效率及頻率。另外還有GC框（GCbox）、八聚核苷酸元件（octamerelement）等元件。Ⅱ類基因的啟動子和調控區

TATA框

核心元件起始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5構成，

位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ識別信號。

CAATbox、Ⅱ類啟動子上游元件組成GCboxOct

增強子（enhancer）遠端調控區減弱子（dehancer）

靜息子（silencer）上游激活序列（upstreamactivatingsequencesUASs）

在不同的啟動子中，這些元件的組合情況是不同的。各種元件將相應的蛋白因子結合到啟動子上，而這些蛋白因子共同組合成起始復合物。人類Ⅱ型啟動子的基礎轉錄因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ≥10K 依賴模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K穩定TFⅡD和DNA的結合，激活TBP亞基 TFⅡB 33K 結合模板鏈（-10～+10），起始PolⅡ結合，和TFⅡE/F

相互作用 TFⅡD (TBP,30K)TBP亞基識別TATA，將聚合酶組入復合體中，TAFs識別特殊啟動子 TFⅡE 34K(β)結合在PolⅡ的前部，使復合體的保護區延伸到下游

57K(α)TFⅡF 38,74K 大亞基具解旋酶活性（RAP74）,小亞基和PolⅡ結合，介導其加入復合體 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸 TFⅡI 120K 識別Inr，起始TFⅡF/D結合 TFⅡJ 在TFⅡF后加入復合體，不改變DNA的結合方式 TFⅡS RNA合成延伸 3.RNA聚合酶Ⅲ啟動子的結構RNA聚合酶Ⅲ轉錄5SrRNA、tRNA和部分snRNA。這三種啟動子的結構是不同的，RNA聚合酶Ⅲ也必須和其他的輔助因子共同作用，才能識別不同的啟動子。5SrRNA和tRNA基因的啟動子位于轉錄起始點的下游，稱為內部啟動子（internalpromoter）。snRNA基因的啟動子位于轉錄起始點的上游，和其他基因的啟動子比較相似。４、研究真核生物啟動子的方法研究真核生物啟動子結構與功能的方法主要有：缺失、點突變和足跡法。研究啟動子的位置及長度用缺失和點突變進行。研究蛋白質輔助因子與啟動子的相互作用可采用DNase、足跡法及凝膠阻滯法。第三節終止子在轉錄的過程中，提供轉錄終止信號的序列稱為終止子（terminator）。無論是原核生物還是真核生物都可以通過控制轉錄的終止來對轉錄進行調控。這也是基因表達調控的重要手段。一、原核生物的終止子大腸桿菌和噬菌體中進行的體內和體外實驗表明，真正起終止作用的不是DNA序列本身，而是轉錄生成的RNA。在這一點上，終止子和啟動子不同。新生的RNA中可有多處發夾結構。比較不同原核生物的終止子序列，發現其同源性很差。大腸桿菌有兩種類型的終止子：1內在終止子（intrinsicterminator）

又稱為不依賴ρ因子的終止子。只有核心酶和終止子就足以使轉錄終止，不依賴其他其他輔助因子的作用。不依賴ρ因子的終止子在結構上有兩個特征，一個是轉錄生成的RNA形成發夾結構，二是發夾結構末端緊跟著6個連續的