牛卵母細胞體外受精是指在脫離母體的情況下，人為創造母牛體內繁殖條件，在牛體外完成精卵結合，培育出受精卵并在體外培養至桑椹胚或是囊胚階段，將胚胎移植到母牛體內孕育胎兒。體外受精是繁育犢牛的重要技術，在牛繁殖領域應用普遍，涉及到的技術有牛卵母細胞的采集、成熟培養與判斷，牛精子的篩選、獲能，以及具體的受精操作等。針對技術應用關鍵節點及技術參數、操作細節的分析研究，最終達到獲取高質量胚胎的目的，助力于養牛業的高質量發展。1牛卵母細胞體外采集與培養技術1.1牛卵母細胞體外采集技術1.1.1采集方式常用的動物卵母細胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母細胞，采用超排技術從動物的輸卵管采集，但不適用于牛這種大型動物；（2）活體采卵，選擇繁殖性能優秀的母牛，借助腹腔鏡直接采集，對采集母牛的繁殖性能影響較小；（3）從屠宰場獲取，宰殺母牛后直接采集牛卵巢。該采集方式簡單、直接、成本低，可大批量采集。1.1.2采集技術在從屠宰場獲取牛卵巢后，將其放入保溫瓶中，瓶中事先裝入用生理鹽水稀釋的硫酸慶大霉素，溫度大約是30℃，用于保持牛卵巢的新鮮度。在1h內完成卵泡的收集，在實驗室環境下，使用生理鹽水清洗干凈牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，獲取卵泡液，準備進行體外成熟培養。1.2體外成熟培養使用體視顯微鏡篩選質量好的卵母細胞用于體外成熟培養，將篩選出的卵母細胞放入培養液中，培養液中含有17-E2的中央記憶型T細胞1.5μg/mL；胎牛血清10%，促黃體生成素20%；卵泡刺激素20μg/mL。將培養液放入經過溫度校正后的培養箱中，溫度調整至38～39℃，氣象條件為5%的CO2，培養時間22～24h，需根據牛卵母細胞采集時的成熟情況，適當延長1～2h，但不可超過26h，一旦超過牛卵母細胞將進入老化期。1.3體外成熟判定在培養24h后進行牛卵母細胞的成熟檢查，當其進入第二次減數分裂中期則判定為成熟。由于牛卵母細胞成熟需經歷第一次與第二次減數分裂期，整個成熟過程復雜，成熟判定難度較大。因此一般情況下以生發泡破裂或是卵丘細胞擴展為判斷標準，以顯微鏡檢查卵丘細胞擴展為例，1級成熟卵，卵丘細胞擴展程度超過裸卵直徑的3倍，2級則是2倍，3級為輕度擴展，大于3級的情況下則可判定牛卵細胞成熟，具備進行體外受精的條件。2牛精子體外獲能技術牛精子體外獲能是提高受精率的重要方式，只有其在母牛的生殖道內停留一段時間，在適宜的溫度、pH值、滲透壓等條件下，牛精子發生一系列的變化后獲取受精能力。如果直接將精子與牛卵母細胞結合，牛精子在未獲能的情況下，受精率非常低。所以在牛卵母細胞體外受精過程中，精子體外獲能技術的應用是其中的關鍵環節，在體外環境下誘導牛精子獲能，進一步的培養其受精能力。2.1影響獲能因素精子體外獲能技術是創造與精子體內獲能相似的條件，促進牛精子正常的生理與生行反應。通過牛精子體內獲能過程的分析，確定了如下影響牛精子獲能因素：（1）精子來源，牛精子獲能時間大約為1h，牛采精部位的不同會直接影響到牛精子獲能，在精子體外獲能操作過程中，需重點關注該影響因素。（2）溫度，牛精子所處獲能環境細微的溫差變化對精子獲能有著一定的影響，經過大量的實踐發現，牛精子體外獲能最佳溫度是38.5～39℃，大部分哺乳動物是37～38℃。（3）pH值，最佳pH7.4～8.0，偏高會減少體外獲能時間，過高則會殺死精子，偏低則增加獲能時間。（4）滲透壓，滲透壓在295～315mOsm/L的條件下，牛精子體外獲能效果最好。（5）鈣離子載體，其對牛精子頂體反應有著積極作用，有助于糖酵解，為精子運動提供充足的能量。鈣離子載體與鈣離子形成復合物，進入精子促進其頂體反應。但如果鈣離子載體濃度過高，作用過于強烈，作用時間過長會引起精子死亡。（6）氨基多糖，氨基多糖有利于鈣吸收，促進牛精子發生頂體反應。但氨基多糖的類型不同，影響著牛精子的獲能水平。比如在牛精子液體中添加肝素10～50μg/mL，處理10～50min，誘導牛精子體外獲能效果良好。（7）高離子強度液，使用滲透壓為380mOsm/L的高離子強度液氯化鈉處理牛精子，置換精子表面的抗原物質，刺激牛精子的頂體反應。（8）咖啡因，具有抑制環腺苷酸二酯酶的作用，提升精子活力，與鈣離子載體、肝素等聯合運用，可增加牛精子獲能的水平。（9）血清白蛋白，其為大分子物質，在處理牛精子過程中，與精子膜中的膽固醇結合，減少了精子脂肪，釋放精子活力，提高牛精子的受精率。2.2精子篩選方法未經處理的牛精液中含有一些有害物質，采用精子預處理方法去除其中的精清、死精子、弱精子等，篩選出適合體外受精的精子，以改善精子獲能。比較常用的處理方法有精子上浮法、Percoll密度梯度分離法、離心洗滌法等。精子上浮法預處理較為簡單，解凍精子后放入TALP培養液中，靜置大約1h，提取上浮的精子。Percoll密度梯度分離法，借助Percoll大分子硅膠顆粒離心處理，平衡分離精子，使不同密度的精子分布在不同密度的梯度中。離心洗滌法適用于冷凍精液，主要是去除冷凍保護劑與精漿蛋白，但在洗滌過程中容易損傷精子。2.3獲能操作方法牛精子體外獲能選用BO液，在其中添加25μg/mL肝素鈉，6μg/mL牛血清白蛋白，培養液pH值調整至7.6。采用精子上浮法篩選出優質精子70μL，制作成精子懸浮液。在培養皿上制作3個100μL的受精液微滴，每個微滴上滴入3μL的精子懸浮液，然后放入CO2濃度為5%，38℃的培養箱中，牛精子持續獲能60min。2.4檢測精子質量在牛精子獲能操作過程中，使用顯微鏡檢測牛精子獲能情況。一方面是精子獲能時檢測，在顯微鏡下可觀察到精子非常活躍，尾部活動明顯；另一方面是精子獲能后檢測，精子在獲能后，頭部曲線運動，尾部鞭打有力，幅度加大，表現為超激活運動。3牛卵母細胞體外受精技術3.1體外受精原理體外受精是成熟牛卵母細胞與獲能牛精子的結合過程，促使牛精子順利進入牛卵母細胞，最終形成胚胎。受精的基本原理是人為創造牛體內受精條件，經過對精子的離心洗滌、上浮處理后，獲取高質量精子，獲能后與成熟卵母細胞共同放入受精液中，促進精卵相遇，完成原核發育。3.2精卵比例把控牛卵母細胞體外受精采用微滴（包含10～15個卵母細胞），微滴大小在50～200μL，精子濃度為0.64～1.0×106個/mL。在牛正常體內受精的情況下，精卵的比例一般是1～15:1，在體外授精的情況下，通過精卵比例的換算，確定精卵比例在10000～20000:1，所以采用了上述的卵母細胞個數與精子濃度。如果精子濃度過低，直接降低受精率，過高則會提升多精受精的概率，降低囊胚發育的質量。3.3精卵作用時間控制體外受精選用的受精液不同，精卵作用的時間會有較大的差異，比如在BO液中大約是7h左右，在TALP液中大約是19h，少于16h會降低受精的質量。在體外受精研究中，有的人使用TALP作為受精液，精卵作用5h后，提取出卵母細胞，然后放入早期培養液中，以此避免水解酶對受精卵的損傷，并且精卵共同孵育時間過長，會增加多精子受精量。所以在使用TALP受精液時，孵育時間不可少于18h，但不可超過24h。3.4體外受精操作方法首先取出培養成熟的牛卵母細胞，放入受精液中洗滌4次；其次平衡處理獲能牛精子，制作成懸浮液微滴，精子濃度為0.8×106個/mL，接著在每個微滴上添加100μL卵母細胞液，保證每個精子微滴上有10～15個卵母細胞；再次，將放有精卵微滴的培養皿放入培養箱中，培養箱中CO2濃度為5%，濕度為100%，溫度為38℃，如果是BO受精液培養時間6～8h，TALP受精液培養時間20～24h。培養過程中使用顯微鏡觀察受精卵的卵裂情況。在體外授精中需注意把握好精卵相遇的時間，最好是精子發生頂體反應時與卵子相遇，以確保精子順利進入牛卵母細胞。牛卵母細胞體外受精還可直接采用顯微鏡進行操作，在顯微鏡下將精子注入牛卵母細胞中，直接完成受精，在精子數量有限的情況下適合采用該方法。3.5受精檢測與判斷卵裂是判斷牛卵母細胞體外受精是否成功的依據，牛卵母細胞在沒有受精的情況下，卵母細胞的周隙很小，在受精后周隙增加，但有的老化卵也會出現該現象，需要繼續培養，觀察囊胚的發育情況。牛卵母細胞體外受精受到人為操作、培養環境與條件的影響，出現異常受精現象，常見的有多精受精、胚胎染色體異常等，應在受精階段做好受精檢測與判斷，及時發現受精異常問題，以提高受精成功的概率。3.6體外受精注意事項3.6.1注意解決多精受精問題在牛卵母細胞成熟判定中，主要的依據是原核發育情況，但原核成熟不是牛卵母細胞成熟判定的唯一標準，還需判斷細胞質、透明帶等的成熟情況，以此方可保證精卵之間的正常作用和變化，形成對多精的防御，避免多個精子在牛卵母細胞中生理變化。在體外受精過程中，可適當增加牛卵母細胞的培養時間，確保完全成熟，或嚴格控制受精時精子的密度，以及進行受精液中影響精子活力物質的調整，以降低多精受精的發生概率。3.6.2避免胚胎發育阻滯的發生胚胎發育阻滯是體外受精面臨的難點，一般好發生在胚胎發育早期，主要的原因是胚型基因激活滯后，導致胚型基因激活失敗。為了避免發育阻滯的出現，在完成牛卵母細胞受精后，利用中間受體（兔或綿羊的輸卵管）培養受精卵至囊胚階段，然后再進行移植操作，也可采用“TCM199+血清”與體細胞（輸卵