第三章NMR實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)4脈沖技術(shù)a頻偏效應(yīng)(off-resonanceeffects) 由于射頻場為單色波，而樣品中的化學(xué)位移有一定的范圍，因此不同的核感受到的有效場也不同。(1)脈沖作用對象為Z磁化向量 在off-resonance狀態(tài)，相位y的脈沖作用于平衡態(tài)的z磁化向量后： 當(dāng)頻偏大時(shí)有明顯的相位及強(qiáng)度的畸變： 這個(gè)式子適合于分析相位與頻偏的關(guān)系。 當(dāng)頻偏不大于射頻場頻率時(shí)，90度脈沖后的水平分量的相位與頻偏基本上是線性關(guān)系， 因此不太大的頻偏下，實(shí)際的90度脈沖可以當(dāng)成理想的90度脈沖，后跟一段演化期，時(shí)間長度為 相比之下，有頻偏時(shí)180度脈沖的效果要差的多，通常需要其他技術(shù)來彌補(bǔ)。 90度脈沖的激發(fā)曲線的第一個(gè)零點(diǎn)位于 180度脈沖的激發(fā)曲線的第一個(gè)零點(diǎn)位于 如蛋白質(zhì)中C的化學(xué)位移平均在56ppm左右,而CO的化學(xué)位移在174ppm左右，若要激發(fā)其中之一同時(shí)對另一個(gè)影響最小，180度方波的功率應(yīng)選擇為,對應(yīng)的脈沖寬度大約58.4s.(2)脈沖作用對象為水平磁化向量(nonresonanteffects) 頻偏較大時(shí)射頻場的有效磁場接近Z向，因此橫向磁化向量在脈沖期間繞Z軸有額外的進(jìn)動，產(chǎn)生相移： 此處<>對脈沖串作平均，在多維譜中當(dāng)p隨間接維時(shí)間變化時(shí)（如去偶序列），這個(gè)相移在對應(yīng)的間接維中表現(xiàn)為一個(gè)頻移該圖顯示的是脈沖寬度58.4s的180度脈沖對橫向磁化產(chǎn)生的額外相移。b組合脈沖(compositepulse) 一般脈沖都受頻偏，射頻場不均勻等的影響，特別是180度脈沖。利用幾個(gè)脈沖組合在一起，完成一個(gè)所需的旋轉(zhuǎn)，就是組合脈沖。其設(shè)計(jì)多樣，目的不盡相同。其效果往往同初始狀態(tài)有關(guān)。作用于Z向的180度脈沖最簡單的可用90x180y90x代替。 效果見圖3.20(p.140)c自旋去偶 在異核實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)核的演化過程中另一個(gè)核加連續(xù)波照射，可產(chǎn)生去偶效應(yīng)，但所需的功率太大。而在一個(gè)回波序列中若僅有一個(gè)核加180脈沖而與其有J偶合的另一核不加脈沖，則在回波點(diǎn)上J偶合不起作用，但回波期間仍起作用。若將整個(gè)期間分成許多短的回波序列，J偶合起作用的時(shí)間相對減少，極限情況下，一連串180脈沖期間，J偶合起作用的時(shí)間更少，這時(shí)就起到自旋去偶的作用。由于180脈沖的性能不佳，通常用組合脈沖來代替180脈沖。并加上各種循環(huán)使其效果更好。 若R代表180度組合脈沖，代表這個(gè)組合脈沖中所有脈沖的相位均反轉(zhuǎn)的結(jié)果，下面的超循環(huán)產(chǎn)生更好的效果： (1)WALTZ系列，基本單元是90x180-x270x,記為 如WALTZ-16: (2)GARP序列，更多的組合脈沖去偶要靠computeroptimization GARP序列由組成，其中R為：30.5055.2180257.80268.318069.3062.218085.0091.8180134.50256.118066.4045.918025.5072.7180119.50138.2180258.4064.918070.9077.218098.20133.6180255.9065.518053.40d選擇脈沖 在許多核磁實(shí)驗(yàn)中需要選擇激發(fā)或選擇抑制技術(shù)。 最簡單的選擇脈沖是低功率的方波（軟脈沖）： 圖中可見，方波激發(fā)有效范圍大約,缺點(diǎn)在于激發(fā)有相當(dāng)?shù)倪厧А?核磁譜儀的發(fā)展是引入成形脈沖發(fā)生器，將一個(gè)脈沖分成幾百甚至幾千個(gè)方波脈沖，每步的強(qiáng)度及相位均可控制，這樣可以產(chǎn)生不同的激發(fā)曲線。但直至今日，要產(chǎn)生完全理想的選擇激發(fā)仍是非常困難的。 圖中可見，Gauss成形脈沖的選擇性較方波好，但相位受頻偏的影響較大。 此圖仍然是同一個(gè)Gauss成形脈沖，但每個(gè)小脈沖的相位加一個(gè)線性變化，其激發(fā)曲線的形狀不變，但激發(fā)峰點(diǎn)移動。 參見圖3.23-3.25(pp.147-149) 此圖顯示的是一種所謂絕熱脈沖的形狀，其特征是相位迅速變化，而且是非線性的，因此射頻激發(fā)的瞬間頻率從激發(fā)譜的一端掃描到另一端，在脈沖作用期間，一個(gè)核感受到的有效場矢量從Z向轉(zhuǎn)向－Z向，其掃描速度慢于核磁矩繞有效場的進(jìn)動頻率即所謂絕熱條件，在這種情況下，核磁矩與有效場矢量同步地運(yùn)動，也從Z向轉(zhuǎn)向－Z向，而受頻偏的影響很小，所以作為180度寬帶選擇脈沖是非常理想的。 由圖中可見其激發(fā)頻譜非常寬而且邊界變化快。最近幾年對絕熱脈沖的研究相當(dāng)多，不斷有新的脈沖形狀被設(shè)計(jì)出來。5水峰抑制技術(shù) 生物樣品如蛋白質(zhì)和核酸的核磁實(shí)驗(yàn)通常要在水中進(jìn)行，因?yàn)樯憝h(huán)境是水溶液。而水的濃度達(dá)110M，因而水峰信號的抑制成為實(shí)驗(yàn)成功的一個(gè)關(guān)鍵。水峰信號的特點(diǎn)：a強(qiáng)度大，較一般生物樣品高出4－5個(gè)數(shù)量級，導(dǎo)致ADC飽和b水的強(qiáng)信號有一個(gè)新的現(xiàn)象，即radiationdamping: 水的橫向磁化向量在探頭的線圈中誘發(fā)出感生電動勢，由于此電動勢極強(qiáng)，又與水的橫向磁化向量本身作用，使其快速返回到Z向，其時(shí)間常數(shù)為,因此雖然水本身的T1時(shí)間在秒的量級，radiationdamping使其信號回復(fù)到Z向的時(shí)間僅有幾十毫秒，這樣也使水峰變得很寬。c水信號還能同樣品中的活潑氫交換 解決措施：a利用高純度重水，還可進(jìn)行重氫交換實(shí)驗(yàn)，但最終所有可交換的活潑氫都消失，其中包括對結(jié)構(gòu)解析非常重要的NH質(zhì)子b預(yù)飽和c選擇激發(fā)d選擇抑制e數(shù)據(jù)處理(1)預(yù)飽和 最基本，最簡單的方法，通常在脈沖的弛豫恢復(fù)期間加低功率的射頻照射(大約50Hz左右)，持續(xù)1－2秒，這種方法對蛋白質(zhì)可用，但有一定條件: 通常蛋白質(zhì)主鏈上的NH與水的交換在pH3附近最慢，因此用于記錄核磁譜的蛋白質(zhì)溶液的pH一般調(diào)節(jié)在3－5之間，盡管在這樣條件下，N端的NH由于與水交換太快，加射頻照射時(shí)的飽和轉(zhuǎn)移也使N端的NH被飽和而不能觀察到；若pH在中性附近乃至堿性，則交換太快，而不能用預(yù)飽和。 核酸堿基上的氨基及亞氨基尤其是亞氨基與水的交換較蛋白質(zhì)高出1－2個(gè)數(shù)量級，加上核酸結(jié)構(gòu)中的氫鍵在中性附近才穩(wěn)定，一般溶液的pH在7左右，因此核酸的核磁實(shí)驗(yàn)不能用預(yù)飽和。 水峰抑制的效果同樣品的磁場均勻程度有很大關(guān)系，也與樣品本身的性質(zhì)如黏度等有關(guān)。(2)Jump-return/Binomialsequences 屬于選擇激發(fā)，但水峰抑制程度偏小，適用于比較簡單的脈沖序列。常用的有,等。(3)spin-lock/gradientpulses 參見圖3.28(p155) 尤其是WATERGATE及waterflip-back技術(shù)效果較好，在多維譜中用的很多6一維譜的一般步驟a樣品準(zhǔn)備 樣品要求可溶，通常樣品管裝樣量為0.4-0.6ml,一般用5mm樣品管，標(biāo)記樣品特別是大蛋白要有1－2mM,非標(biāo)記的小蛋白可更高一些。 樣品必須離心，除去懸浮顆粒，不能有順磁性的污染。 樣品在所用溶液狀態(tài)下必須足夠穩(wěn)定，因?yàn)楹舜艑?shí)驗(yàn)經(jīng)常要數(shù)周至數(shù)月時(shí)間。 由于不同pH，不同溫度下樣品中化學(xué)位移的分散程度不一，盡量尋找最佳條件。 很多蛋白質(zhì)的一定條件下特別是濃溶液中會聚集，形成多聚體，要盡量避免。b調(diào)諧 線圈在插入樣品管后要影響其諧振狀態(tài)包括品質(zhì)因子等，所以實(shí)驗(yàn)前首先要調(diào)節(jié)探頭狀態(tài)，使其諧振頻率對準(zhǔn)所用的射頻頻率，同時(shí)探頭的輸入阻抗與放大器的輸出阻抗匹配，這樣才能將射頻能量有效地傳送到探頭，否則反射回去的能量會損壞放大器等。c鎖場 所有樣品必須含有鎖場介質(zhì)，現(xiàn)代譜儀一般都用氘鎖，所以即便是水溶液，也要加5-10%的重水。鎖場既提供場頻連鎖機(jī)制，及時(shí)補(bǔ)償磁場的漂移，也為勻場提供一個(gè)手段。d勻場 就是調(diào)節(jié)室溫勻場線圈的電流，使磁場盡量均勻。判別勻場好壞的標(biāo)準(zhǔn)通常用鎖場信號的強(qiáng)弱或直接觀察FID的形狀。e脈沖寬度的校正 不同樣品特別是氫的90度脈沖寬度不一樣，脈寬正確與否對簡單的一維譜關(guān)系不大，但對二維三維譜很重要，必須仔細(xì)測量。通常觀測180度或360度脈沖的效果來測量90度脈寬。 譜儀上表征射頻場功率強(qiáng)度用衰減分貝（Bruker儀器），即分貝值越大，射頻功率越小： 此處P為功率，V為電壓，由于產(chǎn)生的磁場強(qiáng)度與電壓成正比，核磁矩圍繞磁場進(jìn)動的頻率又與磁場強(qiáng)度成正比，因此此處V可用進(jìn)動頻率代替。而進(jìn)動頻率的倒數(shù)即周期或360度脈寬，故兩個(gè)90度脈沖寬度的比值的對數(shù)乘以20就是這兩個(gè)脈沖功率的分貝值之差。記住：這個(gè)分貝是衰減分貝。這樣可以從一個(gè)功率下的脈寬推算其他功率下的脈寬，實(shí)際的脈寬會有一些差別，這要視儀器的線性程度。 通常氫的脈沖寬度可直接觀測來測定，其他通道的核的脈寬可直接測（需要濃樣品或標(biāo)記樣品），或間接測(圖3.33,p171)f循環(huán)延遲 一般要大于T1,對小肽需要1秒多，大蛋白質(zhì)小于1秒即可。g定標(biāo) 早期核磁實(shí)驗(yàn)一定要有定標(biāo)物質(zhì)（或內(nèi)標(biāo)，或外標(biāo)），現(xiàn)代數(shù)字化譜儀可以精確確定射頻場頻率，可以由鎖場信號的位置間接計(jì)算。 一般生物樣品溶于水中，同時(shí)為水峰抑制緣故，射頻場頻率常放在水峰位置