一、工作簡況

1.任務來源

本標準經中國材料與試驗團體標準委員會（以下簡稱：CSTM標準委員會）科學試驗領

域委員會審查，CSTM標準委員會于2022年6月批準《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學檢測透

射電子顯微鏡法》立項。標準項目歸口管理委員會為CSTM/FC98/TC02科學試驗領域委員會

科學試驗創(chuàng)新方法技術委員會，標準計劃編號為CSTMLX980200999—2022，由浙江大學

牽頭承擔《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學檢測透射電子顯微鏡法》團體標準的制定工作。

2.標準制定的背景和目的

玉米褪綠斑駁病毒（Maizechloroticmottlevirus,MCMV）是侵染玉米、小麥、大麥、

燕麥、高粱、甘蔗等禾本科作物的重要檢疫性病毒病原，被列入《中華人民共和國進境植

物檢疫性有害生物名錄》，是我國各地植物保護檢疫機構嚴密監(jiān)控的對象。該病毒多年來在

各地出入境口岸時有檢出，2009年在我國云南元謀縣大田玉米上發(fā)生玉米致死壞死病（corn

lethalnecrosis，CLN），浙江大學謝禮等運用電子顯微鏡觀察、血清學檢測和分子鑒定技術，

首次報道了該病病原的鑒定結果，確定主要病原為MCMV（LiXie，2011），這是在中國境

內第一次發(fā)現(xiàn)MCMV危害大田農作物。2015年國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局和國家標準化

管理委員會頒布了我國第一部《玉米退綠斑駁病毒檢疫鑒定方法》國家標準（GB/T

31810-2015），成為玉米退綠斑駁病毒檢疫檢測工作的規(guī)范。在這部標準中規(guī)定了基于血

清學技術的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（DAS-ELISA）檢測、RT-PCR檢測、實時熒光RT-PCR

檢測等技術方法，但沒有涉及到應用電子顯微鏡檢測診斷MCMV的技術方法。

病毒是自然界最小的生命形式，必須借助于透射電子顯微鏡才能顯示其形態(tài)結構，在

病毒病原的檢測診斷中，往往強調“眼見為實”，形態(tài)結構是診斷病毒種類的重要依據(jù)。

通常情況下運用負染色和超薄切片電鏡觀察就能診斷和鑒別植物病毒，一般可以診斷到屬

的水平，有的細胞病變特征還能幫助鑒別到病毒的種。在出入境檢驗檢疫工作中，對于植

物病毒除了需要抗體檢測或分子檢測的證據(jù)外，還需要病毒粒子的形態(tài)照片。即使在日常

的植物病毒研究工作中，常常也需要電鏡的形態(tài)學觀察結果作為實驗佐證。MCMV是類番

茄叢矮病毒目（Tolivirales）、番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）、玉米褪綠斑駁病毒屬

（Machlomovirus）的唯一成員，為直徑30nm的二十面體球狀病毒，在玉米病株細胞內含

量極高，其組織粗汁液經負染色后在透射電鏡下很容易觀察到。該病毒還引起細胞內過氧

化物酶體和線粒體結構改變，過氧化物酶體產生周邊復制小泡，線粒體囊泡化病變，在其

囊泡結構中積累大量纖維狀物質，隨著線粒體崩解，纖維狀物質釋放到細胞質，是鑒別

MCMV的重要細胞病理結構特征。我們自2009年起研究MCMV，先后承擔了農業(yè)部公益

性行業(yè)（農業(yè)）科研專項“稻麥重要病毒病株系鑒定和防控技術體系研究”，國家自然科

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學基金面上項目“兩種二十面體植物病毒的低溫電鏡三維重構研究”等項目，建立了MCMV

單克隆抗體ELISA快速檢測方法，在國際上首次運用低溫電鏡研究MCMV的三維空間結

構。在日常接受大田病樣和入境抽檢樣品的過程中，發(fā)現(xiàn)采用透射電鏡對田間玉米病樣進

行負染色快速檢測，結合超薄切片觀察組織細胞病理變化，可以準確診斷MCMV，與抗體

檢測結果的吻合度非常高。即使是玉米種子病毒含量較少的情況下，也可以通過免疫吸附

電鏡技術來富集病毒，提高病毒的檢出率。在當前快遞業(yè)非常發(fā)達的情況下，基層農業(yè)機

構和農戶可以通過快遞郵寄病樣到專業(yè)電鏡實驗室，可以較快地得到檢測結果。

透射電鏡為大型精密儀器，技術要求較高，用透射電鏡技術檢測植物病毒雖然廣泛應

用于高等院校、科研院所、檢驗檢疫機構，但由于各個電鏡實驗室技術能力的差異，在具

體操作上缺少統(tǒng)一標準，往往造成檢測結果差別很大。迄今為止還沒有一個國家或者行業(yè)

標準可用于規(guī)范MCMV的電鏡檢測分析，我們也沒有查到相應的國際標準。因此，有必要

先制定一部規(guī)范MCMV透射電鏡形態(tài)學檢測診斷的團體標準，把關鍵的樣品前處理程序以

及電鏡判定標準確定下來，以保證檢測結果的準確性和科學性。鑒于此，我們在長期從事

植物病毒研究工作的基礎上，結合我國的實際情況，提出了制定《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)

學檢測透射電子顯微鏡法》的計劃。該標準的制定有助于規(guī)范MCMV的透射電鏡檢測診

斷，可在高等院校、科研院所、基層企事業(yè)單位的電鏡實驗室宣貫推廣，該標準為國內首

個MCMV形態(tài)學電鏡檢測團體標準，具有重要的理論意義和實用價值。

3.工作主要過程

（1）起草階段：

在以往工作的基礎上，聯(lián)合云南省農業(yè)科學院、珠海市拱北海關技術中心、上海市海

關動植物與食品檢驗檢疫技術中心等單位組建成立了標準起草工作組，確定了標準編寫原

則和分工，提出標準編制進度安排。于2022年6月完成《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學檢測透

射電子顯微鏡法》初稿，經過相關合作單位的意見征詢以及部分實驗補充驗證，于2022年

9月完成征求意見稿。

（2）征求意見階段：

2022年10月通過CSTM網上系統(tǒng)遞交《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學檢測透射電子顯微

鏡法》征求意見稿和編制說明，廣泛征求意見。

4.主要參加單位及工作組成員

主要參加單位包括：浙江大學，云南省農業(yè)科學院，珠海市拱北海關技術中心，上海

市海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心。

工作組成員包括：洪健，謝禮，王華，李云琴，尚衛(wèi)娜，吳建祥、張仲凱、張衛(wèi)東、

于翠。

二、標準化對象簡要情況及制修訂標準的原則

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1.標準化對象簡要情況

本標準為旨在規(guī)范本領域內各標準的制修訂和發(fā)布。

2.制修訂標準的原則

（1）制修訂標準的依據(jù)或理由

依據(jù)中國材料與試驗團體標準制修訂管理細則、中關村材料試驗聯(lián)盟團體標準管理辦

法（試行）制定本標準，規(guī)范本領域內各標準的制修訂和發(fā)布。

（2）制修訂標準的原則

本標準編制遵循經濟社會發(fā)展需求原則、技術先進和經濟合理原則、適應貿易全球化

需求原則、維護公眾利益原則、協(xié)商一致原則、廣泛參與和公開透明原則。本標準在結構

編寫和內容編排等方面依據(jù)GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的

結構和起草規(guī)則》進行編寫。

三、采用國際標準和國外先進標準的情況

無

四、標準制定的原則與主要技術內容

植物病毒的透射電鏡形態(tài)檢測主要采用負染色技術、超薄切片技術、免疫電鏡技術，

這些技術方法是經過長期實踐證明穩(wěn)定可靠的通用性方法，所制備的植物病毒樣品適用于

各種型號的生物透射電鏡觀察。因此，我們在編制標準具體條款時，主要列舉了樣品制備

的過程和要求，對于透射電鏡，只列出了觀察條件的選擇原則，針對某一臺儀器的具體操

作步驟建議參照儀器操作說明書。在樣品前處理程序中，列舉了負染色技術、超薄切片技

術、免疫電鏡技術的基本步驟，涉及樣品前處理過程所用到的制樣設備如超薄切片機、玻

璃制刀機、包埋聚合器、高速離心機的具體操作步驟也建議參照儀器說明書。

本標準規(guī)定了應用透射電鏡對玉米褪綠斑駁病毒進行形態(tài)學檢測的技術要求與規(guī)范，

標準適用于該病毒的檢驗檢疫以及田間樣品的形態(tài)學診斷鑒定。主要內容包括：

1范圍

2規(guī)范性引用文件

3術語和定義

4原理

5儀器設備、試劑和材料、環(huán)境條件

6樣品

7檢測步驟

8實驗數(shù)據(jù)處理

9檢測結果發(fā)布

附錄A玉米褪綠斑駁病毒相關資料

附錄B常用試劑配方

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附錄C玉米褪綠斑駁病毒電鏡照片

附錄D起草單位和主要起草人

五、試驗驗證分析

1.負染色電鏡觀察：將采自云南呈明顯癥狀的玉米病葉剪碎，在研缽中加0.05mol/L磷

酸緩沖液研磨后用覆Formvar膜的電鏡銅網蘸取組織粗汁液，經2%磷鎢酸（pH6.7）負染

色。將帶病毒的種子種皮加磷酸緩沖液研磨后，經2%磷鎢酸（pH6.7）負染色。

2.免疫吸附電鏡觀察：將銅網膜面朝下放置于1:10~1:100倍稀釋的MCMV抗體抗體

液滴上保濕孵育15min，用20滴0.05mol/L的磷酸緩沖液（pH值7.0）滴洗銅網，洗除多

余抗體。用濾紙片吸掉余液后，將銅網放置于病毒樣品懸液滴上保濕孵育30min（如種子

的病毒含量低，反應時間可延長至數(shù)小時或過夜）。用20滴0.05mol/L的磷酸緩沖液、30

滴雙蒸餾水先后連續(xù)滴洗樣品銅網，吸除余液后以2%磷鎢酸（pH值6.8）負染色。

3.超薄切片電鏡觀察：取病葉退綠黃化邊緣部位切成2mm×4mm小片，用0.1mol/L

磷酸緩沖液配置的2.5%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定，乙醇梯度脫水，丙酮替代，Supper’

樹脂包埋，在德國LeicaUC7型超薄切片上用鉆石刀切成70nm厚的超薄切片，檸檬酸鉛

和醋酸雙氧鈾雙重染色。

上述樣品均在日立HitachiH-7650型透射電鏡下觀察，加速電壓為80kV，用美國Gatan

832型CCD相機記錄圖像。

4.觀察結果分析：

（1）田間癥狀：云南大田玉米新葉出現(xiàn)褪綠、黃綠色的癥狀，隨著病害的發(fā)展，葉片

上高密度的褪綠斑點非常顯著；成株期發(fā)病植株比正常植株矮小，生長緩慢，節(jié)間短植株

明顯矮化，嚴重受害植株不能抽穗和結苞，大部分葉片枯萎。

圖1.大田玉米感染MCMV的發(fā)病狀況圖2.感染MCMV玉米病株葉片退綠癥狀

（2）負染色和免疫吸附電鏡觀察結果：感染MCMV的玉米病葉或種子研磨得到的粗

汁液經負染色或免疫吸附后負染色，在透射電鏡下觀察到許多球狀病毒粒子，直徑約為30

nm左右，同時還能觀察到復合侵染的線狀病毒粒子。

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圖3.玉米病葉粗汁液中的MCMV粒子圖4.粗提純的MCMV粒子

（3）超薄切片電鏡觀察結果：在MCMV感染的病變細胞中可以觀察到大量球狀病毒

粒子分散在細胞質內，還有結晶狀排列的病毒聚集體；過氧化物酶體增生并聚集，形成周

邊復制小泡；線粒體呈現(xiàn)囊泡化病變，在由線粒體內脊形變而成的囊泡結構中積累了大量

纖維狀物質，后期線粒體崩解。

圖5.玉米病葉細胞質中散布的MCMV粒子圖6.細胞質中的MCMV粒子形成結晶

圖7.過氧化物酶體聚集并形成周邊復制小泡；圖8.過氧化物酶體的周邊復制小泡

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圖9.細胞質中的線粒體囊泡化病變圖10.細胞質中